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堿裂解法抽提質(zhì)粒DNA 已有2人參與
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[實驗原理] 質(zhì)粒是存在于染色體外的小型雙鏈環(huán)狀DNA，大小在1-200kb之間，能在宿主菌中自主復制。宿主細胞中質(zhì)粒的拷貝數(shù)各有不同，一種是低拷貝數(shù)的，每個細胞僅含有一個或幾個質(zhì)粒分子，稱為“嚴緊型”復制的質(zhì)粒，另一類高拷貝的質(zhì)粒，拷貝數(shù)可達到20個以上，這種類型稱為“松弛型”復制的質(zhì)粒。 質(zhì)粒能編碼一些遺傳性狀，如抗藥性（氨芐青霉素、四環(huán)素等抗性），利用這些抗性可以對宿主菌或重組菌進行篩選。 質(zhì)粒作為基因工程載體必須具備以下條件（1）復制子（ori）：一段具有特殊結(jié)構(gòu)的DNA序列；（2）有一個或多個便于檢測的遺傳表型，如抗藥性、顯色表型反應(yīng)等；（3）有一個或幾個限制性內(nèi)切酶位點，便于外源基因片段的插入；（4）適當?shù)目截悢?shù)。制備質(zhì)粒載體是分子生物學的常規(guī)技術(shù)。 堿裂解法是一種應(yīng)用最為廣泛的制備質(zhì)粒DNA的方法，其基本原理為：當菌體在NaOH和SDS溶液中裂解時，蛋白質(zhì)與DNA發(fā)生變性，當加入中和液后，質(zhì)粒DNA分子能夠迅速復性，呈溶解狀態(tài)，離心時留在上清中；蛋白質(zhì)與染色體DNA不變性而呈絮狀，離心時可沉淀下來。 純化質(zhì)粒DNA的方法通常是利用了質(zhì)粒DNA相對較小及共價閉環(huán)兩個性質(zhì)。例如，氯化銫-溴化乙錠梯度平衡離心、離子交換層析、凝膠過濾層析、聚乙二醇分級沉淀等方法，但這些方法相對昂貴或費時。對于小量制備的質(zhì)粒DNA，經(jīng)過苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等簡單步驟去除殘余蛋白質(zhì)和RNA，所得純化的質(zhì)粒DNA已可滿足細菌轉(zhuǎn)化、DNA片段的分離和酶切、常規(guī)亞克隆及探針標記等要求，故在分子生物學實驗室中常用。 [實驗?zāi)康腯 1、掌握堿裂解法抽提質(zhì)粒DNA的原理和方法。 2、掌握紫外吸收光譜法測定核酸含量的原理和方法。 [實驗步驟] 1、試劑配制 （1）LB培養(yǎng)液 10 g Tryptone，5 g Yeast Extract，10 g NaCl，雙蒸水定容至1000mL，高壓滅菌后4℃保存。 （2）LB平板培養(yǎng)基 在LB液體培養(yǎng)基中加入瓊脂粉15g，高壓滅菌，冷卻至45℃左右時倒平皿，4℃保存。 （3）LA平板培養(yǎng)基 待LB液體培養(yǎng)基冷卻至45℃左右加入Amp (100μg/mL)，搖勻后倒平皿，4℃保存。 （4）溶液I：50 mmol/L葡萄糖，25 mmol/L Tris-HCl(pH8.0),10 mmol/L EDTA (pH8.0), 配制200ml。 取葡萄糖（C6H12O6.H2O）1.982 g，雙蒸去離子水160 ml，0.5 mol/L EDTA 4ml，1 mol/L Tris-HCl(pH8.0) 5 ml，定容至200 ml，高壓滅菌后4℃保存。 （5）溶液II：0.2 mol/L NaOH, 1%SDS。 配制100 ml，現(xiàn)用現(xiàn)配。 10 mol/L NaOH 2 ml，雙蒸去離子水80 ml，10%SDS 10 ml，最后用雙蒸去離子水定容至100 ml，室溫保存。 （6）溶液III：配制100 ml。5 mol/L 乙酸鉀 60 ml，冰乙酸11.5 ml，雙蒸去離子水28.5 ml。 （7）5 mol/L 乙酸鉀（200 ml），乙酸鉀98.14 g，溶解于160 ml雙蒸去離子水中，攪拌溶解后定容至200 ml。 （8）3 mol/L 乙酸鈉（NaAc）（pH5.2)，取乙酸鈉（CH3COONa.3H2O) 204.1g，溶解于200 ml雙蒸去離子水中，用冰乙酸調(diào)pH5.2，雙蒸去離子水定容至500 ml，高壓滅菌后4℃保存。 （9）10 mol/L NaOH溶液（100 ml），NaOH晶體40 g，加水至100 ml。 （10）10%SDS， 稱取SDS 10g，溶解于80 ml水中，68℃助溶，加數(shù)滴1 mol/L HCl調(diào)pH7.2,定容至100 ml。 （11）0.5 mol/L EDTA（pH8.0) （100 ml）。Na2EDTA.2H2O 18.61 g, H2O 70 ml，邊攪拌邊加入NaOH固體調(diào)節(jié)pH，接近pH8.0時才充分溶解，大約需NaOH 2g。最后加水至100 ml。 （12）TE緩沖液（pH8.0） （100 ml），10 mmol/L Tris-HCl（pH8.0），1 mmol/L EDTA（pH8.0）。 2、細菌的培養(yǎng) （1）配制LB液體，在瓊脂糖平板培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)出單菌落（37℃，16-20小時）。 （2）在滅菌過的10 ml玻璃培養(yǎng)管中加入3 ml LA液體培養(yǎng)基、以及3微升Amp (100 ug/ml)，挑取單菌落至培養(yǎng)基中。將培養(yǎng)管置于搖床中，３７℃振搖過夜(200-250 rpm,16-18小時)。 3、質(zhì)粒的提取 （1）吸取1.5毫升菌液至1.5 ml Eppendorf離心管中，3 000 rpm離心3分鐘，棄上清液。 （2）加上1.5毫升菌液，重復操作（１）。 （3）用移液器盡可能除去上清液，加入150微升溶液Ｉ，用旋渦振蕩器充分懸浮菌體。 （4）加入250微升溶液Ⅱ,緩慢地上下翻轉(zhuǎn)離心管約10次，混合均勻。室溫下放置５分鐘。 （5）加入200微升溶液Ⅲ，上下翻轉(zhuǎn)離心管約10次，混合均勻，冰浴10分鐘。４℃，14,000 rpm離心5分鐘。 （6）用移液器將上清液轉(zhuǎn)移到新的1.5 ml Eppendorf離心管中，加入１倍體積酚／氯仿抽提，14 000 rpm離心５分鐘。 （7）重復步驟（6）1次。 （8）移取上清液（400－500微升），加入2倍體積無水乙醇、0.1倍體積3 mol/L醋酸鈉，置于－20℃冰箱30分鐘。 （9）14 000 rpm 離心10分鐘，盡量去掉酒精。 （10）用0.5 ml 70％酒精洗DNA沉淀１次，離心２分鐘，盡量去掉酒精，風干１０分鐘。 （11）加50微升TE緩沖液溶解DNA沉淀，然后加入１微升RNase，37℃過夜，－20℃保存。 4、DNA濃度測定 （1）標準曲線的制作 分別用蒸餾水將DNA標準品配制成濃度為5μg、10μg、20μg、30μg、40μg、50μg/mL的DNA溶液，于260 nm處測定光吸收值，在電腦中用軟件制作標準曲線。 （2）樣品測定 取20微升質(zhì)粒DNA置一干凈的離心管中，加入2 980微升蒸餾水稀釋。然后用紫外分光光度計測定260nm和280nm的光吸收值。計算DNA濃度，并通過OD260/OD280比值評估樣品純度。 |
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