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555weiteng新蟲(chóng) (初入文壇)
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[求助]
絲狀真菌基因敲除 篩不出完全敲除的菌 已有2人參與
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絲狀真菌用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法做基因敲除，上下游同源臂分別為3KB，在抗性板上出現(xiàn)的轉(zhuǎn)化子做PCR驗(yàn)證，若敲除掉應(yīng)該只有一條3KB的電泳條帶，野生型只有一條1KB的帶�，F(xiàn)在挑了100個(gè)菌，出現(xiàn)的是只有1KB和兩條帶都有的情況。出現(xiàn)兩條帶的菌用另一對(duì)引物驗(yàn)證，顯示部分基因組發(fā)生雙交換，但不完全。請(qǐng)問(wèn)一下做過(guò)真菌敲除實(shí)驗(yàn)的高手們，是菌沒(méi)挑對(duì)，還需繼續(xù)挑，還是需要對(duì)那些部分雙交換的菌進(jìn)行純化，知道篩到純的。 發(fā)自小木蟲(chóng)IOS客戶端 |
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這是沒(méi)有同源重組，直接插入突變了吧，一百個(gè)都沒(méi)有出來(lái)，再挑菌成功希望也不是很大，出現(xiàn)兩條帶的八成是插入突變了，建議重新轉(zhuǎn) 發(fā)自小木蟲(chóng)IOS客戶端 |
3樓2017-12-01 15:50:29
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2樓2017-08-19 20:39:34
4樓2017-12-02 11:35:13
lggy1321
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5樓2017-12-23 22:50:14
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重新轉(zhuǎn)了挑了500個(gè)還是沒(méi)有，請(qǐng)問(wèn)一般敲不掉多做幾遍會(huì)敲掉嗎？做了兩遍都沒(méi)敲掉，都懷疑是否能敲掉了。 發(fā)自小木蟲(chóng)IOS客戶端 |
6樓2018-03-20 11:45:32
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7樓2018-03-20 11:45:56
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8樓2018-03-20 11:47:59
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【答案】應(yīng)助回帖
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查查文獻(xiàn)看看是不是敲除致死，敲除致死的話也挑不出轉(zhuǎn)化子，并且篩選平板上菌落不會(huì)太多。如果致死，可以選擇干擾。 如果敲除不致死，這樣的情況就要考慮敲除材料和敲除體系有沒(méi)有問(wèn)題了，下次轉(zhuǎn)的時(shí)候可以用一個(gè)驗(yàn)證正確帶熒光的載體測(cè)一測(cè)敲除體系效率,再好好檢查一下你的載體左右臂有沒(méi)有問(wèn)題，和基因組中其他編碼區(qū)同源性怎么樣。 發(fā)自小木蟲(chóng)IOS客戶端 |
9樓2018-03-20 12:27:39
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。 10樓2018-03-27 16:43:19
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