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片段連了半年了，死活連不上，要看再不行就要延期了，求大神幫忙分析一下 已有3人參與
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首先我一共要連接三個片段，直接連接表達(dá)載體，這三個片段都屬于同一個基因家族，就是同源性不高，片段是pcr得到的（提取的研究材料全RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA），采用雙酶切的方法，選取的是sal1和BamH1兩個酶切位點(diǎn)，這兩個酶切位點(diǎn)在載體上離得很近，序列是（GTCGAC）TCTAGA（GGATTC），只間隔了6bp，不過我通過先用sal1酶切在用BamH1酶切的方法已經(jīng)連接上了兩個片段，這能說明我的載體酶切肯定是沒問題的吧？而且三個片段都是同一操作流程，也就是說我設(shè)計的引物也沒問題吧？片段酶切也沒問題吧？但是，第三個片段，也是最關(guān)鍵的片段，就是死活連不上去，連上那兩個片段其實就用了三個星期……本來我想著，因為原來的載體酶切后不好判斷酶切程度，我可以通過酶切已經(jīng)連上目的片段的重組質(zhì)粒，跑膠回收酶切好的載體來做連接，但是，重組質(zhì)粒，一切就碎，就跟pcr的引物二聚體似的，根本沒法回收，重新提了一批原始質(zhì)粒和片段做酶切，用50的體系，酶各加2，酶切4小時，跑膠發(fā)現(xiàn)，竟然也被切碎了，然后，減小酶量，各加1，發(fā)現(xiàn)還是碎了，是因為這次用的大體系酶切么？我之前酶切用的25的體系……求各位大神幫忙分析一下，描述比較混亂，我現(xiàn)在特別絕望…… @飛約瘋?cè)嗽?/u> @biostar2009 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
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 質(zhì)粒表達(dá) |
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都測序過了，應(yīng)該是沒問題的啊……酶切時間是有點(diǎn)長，一般半個小時就夠了…… 搞不定就找公司做啊……PCR克隆也就幾百塊，何必糾結(jié)大半年 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
23樓2017-09-18 07:53:43
NEVER000
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31樓2017-09-19 22:29:42
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西門吹雪170: 金幣+1, 鼓勵回帖交流 2017-09-17 12:42:22
西門吹雪170: 金幣+1, 鼓勵回帖交流 2017-09-17 12:42:22
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既然總是會切碎，就不要用酶切的方法嘍。換換overlap的方法，推薦用一下天根的EasyGeno，便宜好用，我們現(xiàn)在都用這個。NEB的也用過，太貴了。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
5樓2017-09-17 09:46:47
6樓2017-09-17 17:23:27
不吃M的魚
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10樓2017-09-17 18:39:44
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按道理酶切位點(diǎn)單一的話，特異性應(yīng)該很好。你用的那個公司的酶，換個牌子試試，或者換個快切的酶，另外酶切時間不要太長，酶切完記得終止反應(yīng)，防止亂切。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
21樓2017-09-17 23:37:34
ken19860823
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【答案】應(yīng)助回帖
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拙見如下： 1. 千萬不要把你確定連上的重組載體作為第三個片段的載體，除非你能確定用重組載體做載體時能夠酶切完全。 2. T載體買著不貴，或者你可以借，其實也可以自己做，方法網(wǎng)上有。你把PCR產(chǎn)物連到T載上，轉(zhuǎn)化的大腸桿菌保存，需要擴(kuò)增的時候也不需要PCR了，搖菌過夜提質(zhì)粒就行，而且這個酶切結(jié)果更可靠。 3. 你的PCR引物是怎樣設(shè)計的？兩端是酶切位點(diǎn)嗎？那有沒有設(shè)計保護(hù)堿基呢？這會影響你的酶切效果。 4. 你是如何確定自己的重組質(zhì)粒構(gòu)建成功的？酶切、PCR、測序都沒有問題嗎？測序引物用的什么？ 5. 你的載體和重組質(zhì)粒保存了多久？什么條件？凍融次數(shù)多嗎？會不會已經(jīng)降解了？ |
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