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[求助]
DsRed2作為融合蛋白標(biāo)簽
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最近遇到了一個(gè)難題，我要表達(dá)一段原核膜蛋白，在膜蛋白的C段連接了一個(gè)紅色熒光蛋白DsRed2，20度誘導(dǎo)，熒光監(jiān)測(cè)，48h后熒光強(qiáng)度不再增加（此時(shí)菌體用肉眼觀察已經(jīng)非常紅），收集菌體，高壓低溫破碎三次，14000rpm離心，但是離心后發(fā)現(xiàn)沉淀比上清還紅,這是什么原因呢？離心后的沉淀不就是未破碎的細(xì)胞，細(xì)胞碎片，還有可能是包涵體么，怎么會(huì)比上清還紅呢？如果是形成了包涵體應(yīng)該看不到顏色呀.離心后的上清用detergent溶解過夜，然后20000rpm離心，發(fā)現(xiàn)上清一點(diǎn)也不紅了，也是沉淀特別紅，我的蛋白去哪了？郁悶，求教高手指教 |
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jasco
木蟲 (正式寫手)
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
丫頭7976: 金幣+1, ★★★很有幫助, 我知道都在沉淀中，只是不是知道怎么辦，文獻(xiàn)中報(bào)道的說如果形成包涵體的話就不會(huì)有顏色了呀 2012-04-14 12:16:10
丫頭7976: 金幣+2, ★★★很有幫助, 我的蛋白形成聚集體了 怎么辦 我想做FRET 蛋白不是單體咋辦呢 至少是四聚體 2012-04-21 11:46:05
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丫頭7976: 金幣+1, ★★★很有幫助, 我知道都在沉淀中，只是不是知道怎么辦，文獻(xiàn)中報(bào)道的說如果形成包涵體的話就不會(huì)有顏色了呀 2012-04-14 12:16:10
丫頭7976: 金幣+2, ★★★很有幫助, 我的蛋白形成聚集體了 怎么辦 我想做FRET 蛋白不是單體咋辦呢 至少是四聚體 2012-04-21 11:46:05
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你可以電泳看看上清和沉淀中蛋白的情況，就知道你的蛋白到哪里去了 另外，包涵體會(huì)有顏色的，如果你連接GFP還會(huì)是綠色的呢 如果電泳確認(rèn)是包涵體，就可以用尿素或者鹽酸胍濃度梯度去溶解包涵體看看最佳的溶解條件 |
2樓2012-04-14 11:48:20
愛科研嘛
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3樓2018-11-07 14:28:50
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4樓2018-11-07 14:30:06
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