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ufolt16新蟲 (初入文壇)
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[求助]
RNA提取質(zhì)量 已有5人參與
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使用方法：Trizol 目的：qPCR 樣品：番茄葉片 問題描述：目前處于預(yù)實驗階段，前后提取了幾次番茄葉片RNA，之前并未太過關(guān)注電泳圖（因為并沒有特別處理，就是一般的跑DNA的膠和緩沖液，私以為電泳可能也有降解效果可能會不好，但是如果嚴(yán)格處理，又太耗時耗力），只是著重測了濃度和OD比值，OD260：OD280一般在1.9到2.0左右，濃度卻很奇怪，有時同時取得兩個樣品，一個六七百ng，一個卻只有八九十一百多，很是糾結(jié)。后來嘗試進(jìn)行qPCR，主要還是想摸摸條件，結(jié)果非常不好，被老板罵，要我跑電泳確認(rèn)RNA質(zhì)量，結(jié)果前后提取的RNA跑了幾次電泳，效果都不好，自己也沒信心，不知道這RNA提成什么樣才能進(jìn)行下一步試驗。有幾個問題希望專家解疑： 1. 提取RNA濃度差異如此大是什么原因？ 2. 就目前提出的RNA的電泳圖看質(zhì)量，有什么問題，下一步怎么改進(jìn)？ 3. 什么程度是滿足qPCR的高質(zhì)量RNA PS：染色是跑完膠扔到EB里染色，每次染色時間沒有特意記，可能有染色不充分的，比如最后一張圖。。。。 第一次提取 第二波，若干次提取，一起跑的電泳 第三次 第四次，第一泳道是第三次提的，2345是第四次提的，1234按照3ul+6ul水上樣，5是4按照6ul上樣 第五次@biostar2009@飛約瘋?cè)嗽?/u>@wizardfan@youlinglyw |
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能測濃度最好，通過吸光度比值看純度，，測不了濃度就跑膠看，首先3條帶清晰沒有明顯拖尾表明純度還可以，takara marke上楊7v（好像是，可以再查一下）750的帶大約亮度對應(yīng)為100ng/v，可以估算rna濃度。建議提取后直接反轉(zhuǎn)錄后上熒光，這樣可以排除某些基因降解速率差異問題，批次間可以trizol-80凍存，一起提，，相對定量只要反轉(zhuǎn)錄后能批出內(nèi)參就好，對rna量沒有太多要求。只要別太高就好。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
12樓2017-05-04 13:19:13
781055707
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2樓2017-05-02 16:39:40
ufolt16
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請問上樣量是什么意思？您看我理解對嗎？trizol的比例是50-100mg：1ml，您的意思是不是指我的葉片按10.20.40…mg還是加1ml trizol來算，請問是這個意思嗎 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
3樓2017-05-02 16:53:04
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4樓2017-05-02 16:57:01
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