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小冀-版主 (著名寫手)
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[求助]
pMD-19T載體與目的片段的連接問題 已有6人參與
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之前計劃目的基因（3.6Kb）與pMD-19T進行TA克隆連接，目的片段用primerstar高保真酶后加A連接，氨芐板生長，鑒定后發(fā)現(xiàn)是載體自連；后來用Taq酶PCR擴增后直接與pMD-19T載體鏈接，最后發(fā)現(xiàn)還是自連的···發(fā)現(xiàn)這都不行后就進行一步克�。–lonExpressTM快速克隆技術(shù)），之前認為在載體是線性的，就直接連了，但是沒有連上，氨芐平板上沒長；后來用以前構(gòu)建好的質(zhì)粒進行雙酶切后進行一步克隆，可是氨芐平板上還是沒有長···各位大神，求助··· 轉(zhuǎn)化條件： 感受態(tài)是自己用氯化鈣法做的，以前也是用它來做轉(zhuǎn)化，都可以的··· 熱擊90s后，37℃活化1h后，將轉(zhuǎn)化液濃縮全部涂平板··· |
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
gyesang: 金幣+3, 鼓勵回帖交流！ 2014-07-25 21:58:19
小冀-: 金幣+1, ★有幫助 2014-07-26 09:24:40
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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小冀-: 金幣+1, ★有幫助 2014-07-26 09:24:40
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這個載體應(yīng)該是可以做藍白斑篩選的吧，做個藍白斑很容易就能看出來有沒有插入基因。一般白斑的插入率應(yīng)該有90%，你的目的片段略大，可能會稍微低一些。確認一下這個大小是否超過了載體的上限。 不知道你的連接體系是怎樣的，你的片段跟載體的大小基本差不多，所以要多加目的片段進行連接，用3：1甚至5：1的比例，加大目的片段的插入效率。沒用過這個載體，也確認一下這個載體是不是能直接用來TA克隆。 至于你后來說的雙酶切后進一步克隆，體系是怎樣的？你的目的基因有相應(yīng)的酶切位點么？ |
13樓2014-07-25 21:29:31
鬼羽帝魂
木蟲 (著名寫手)
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2樓2014-07-25 10:20:16
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4樓2014-07-25 11:38:57
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