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片段連了半年了，死活連不上，要看再不行就要延期了，求大神幫忙分析一下 已有3人參與
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首先我一共要連接三個(gè)片段，直接連接表達(dá)載體，這三個(gè)片段都屬于同一個(gè)基因家族，就是同源性不高，片段是pcr得到的（提取的研究材料全RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA），采用雙酶切的方法，選取的是sal1和BamH1兩個(gè)酶切位點(diǎn)，這兩個(gè)酶切位點(diǎn)在載體上離得很近，序列是（GTCGAC）TCTAGA（GGATTC），只間隔了6bp，不過我通過先用sal1酶切在用BamH1酶切的方法已經(jīng)連接上了兩個(gè)片段，這能說明我的載體酶切肯定是沒問題的吧？而且三個(gè)片段都是同一操作流程，也就是說我設(shè)計(jì)的引物也沒問題吧？片段酶切也沒問題吧？但是，第三個(gè)片段，也是最關(guān)鍵的片段，就是死活連不上去，連上那兩個(gè)片段其實(shí)就用了三個(gè)星期……本來我想著，因?yàn)樵瓉淼妮d體酶切后不好判斷酶切程度，我可以通過酶切已經(jīng)連上目的片段的重組質(zhì)粒，跑膠回收酶切好的載體來做連接，但是，重組質(zhì)粒，一切就碎，就跟pcr的引物二聚體似的，根本沒法回收，重新提了一批原始質(zhì)粒和片段做酶切，用50的體系，酶各加2，酶切4小時(shí)，跑膠發(fā)現(xiàn)，竟然也被切碎了，然后，減小酶量，各加1，發(fā)現(xiàn)還是碎了，是因?yàn)檫@次用的大體系酶切么？我之前酶切用的25的體系……求各位大神幫忙分析一下，描述比較混亂，我現(xiàn)在特別絕望…… @飛約瘋?cè)嗽?/u> @biostar2009 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
回復(fù)此樓» 本帖已獲得的紅花（最新10朵）
ken19860823» 猜你喜歡
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ken19860823
木蟲 (正式寫手)
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- 注冊(cè): 2014-04-20
- 性別: GG
- 專業(yè): 免疫生物學(xué)
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你先別糾結(jié)你那個(gè)中間載體了，你酶切原始載體先連第三個(gè)片段。如果沒問題再連另外兩個(gè)片段。先試試，有些片段克隆有方向性的。如果是這個(gè)問題，換個(gè)載體重新克隆或者換個(gè)感受態(tài)試試。半年早該各種都試過了，現(xiàn)在來這里不知道有用沒啊。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
17樓2017-09-17 22:37:00
2樓2017-09-16 23:20:29
3樓2017-09-16 23:21:54
4樓2017-09-17 09:42:54
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