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【懸賞金幣】回答本帖問(wèn)題，作者小冀-將贈(zèng)送您 62 個(gè)金幣

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小冀-

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[求助] 與PMD-19T連接問(wèn)題已有6人參與

用PMD-19T載體與我的目的基因片段（3.3kb）鏈接，之前用高保真酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增后通過(guò)加A試劑盒進(jìn)行加A尾，之后熱擊轉(zhuǎn)化，涂布后長(zhǎng)出菌落，但是提質(zhì)粒鑒定后發(fā)現(xiàn)載體自連（單雙酶切條帶一樣，只有一條，有一個(gè)不一樣的，但單切有出現(xiàn)兩條條帶）；后來(lái)用一步克隆試劑盒進(jìn)行連接，但涂布后沒(méi)有菌落，一直不知道是什么原因，請(qǐng)高人指教···

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1樓 2014-06-17 08:56:49

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飛約瘋?cè)嗽?/a>

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小冀-(西門(mén)吹雪170代發(fā)): 金幣+1, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-06-18 10:43:26
小冀-: 金幣+3, ★★★很有幫助 2014-10-23 21:51:24

我們實(shí)驗(yàn)室以前用的都是18t19t，可是后來(lái)怎么都不行了，實(shí)驗(yàn)做不出來(lái)，建議你用T-easy吧，很好很適用。

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人生貴在行動(dòng)，遲疑不決時(shí)，不妨先邁出小小一步。

17樓2014-06-18 10:24:48

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小冀-: 金幣+1 2014-06-17 10:51:49
gyesang: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流！ 2014-06-17 15:08:09

平末端的再加A進(jìn)行ta克隆，效率本來(lái)就很低，你可以考慮用taq，循環(huán)數(shù)低一點(diǎn)，多擴(kuò)一點(diǎn)，回收時(shí)少加點(diǎn)水濃縮，連接時(shí)不加水多加PCR產(chǎn)物，試試，祝好

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2樓2014-06-17 09:40:07

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引用回帖:

2樓: Originally posted by Neo2000 at 2014-06-17 09:40:07
平末端的再加A進(jìn)行ta克隆，效率本來(lái)就很低，你可以考慮用taq，循環(huán)數(shù)低一點(diǎn)，多擴(kuò)一點(diǎn)，回收時(shí)少加點(diǎn)水濃縮，連接時(shí)不加水多加PCR產(chǎn)物，試試，祝好

我用Ex-Taq酶做過(guò)一次，片段是P出來(lái)了，而且都說(shuō)用它P的都會(huì)存在A尾，所以就直接連了，鑒定時(shí)還是沒(méi)有連上···

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3樓2014-06-17 10:51:12

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3樓: Originally posted by 小冀- at 2014-06-17 10:51:12
我用Ex-Taq酶做過(guò)一次，片段是P出來(lái)了，而且都說(shuō)用它P的都會(huì)存在A尾，所以就直接連了，鑒定時(shí)還是沒(méi)有連上···...

那說(shuō)明問(wèn)題出在ta克隆這一步，18t是很一般的t載體，建議用pGEM T Easy，NEB的連接酶

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4樓2014-06-17 12:11:58

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