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050241310鐵桿木蟲(chóng) (著名寫手)
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[交流]
提取RNA及用DEPC去除RNase的個(gè)人總結(jié)(轉(zhuǎn)） 已有14人參與
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快速的操作，低溫環(huán)境，少量取上清 主要是抽提之后吸取上清時(shí)要特別小心，只要不把蛋白層吸出來(lái)就不會(huì)有RNase污染。 分子克隆第二版343頁(yè),上關(guān)于提取RNA所用的玻璃容器的處理方法,是用前180度干烤8小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間;另一種方法是0.1%的depc水浸泡(37度2小時(shí)),然后滅菌水淋洗數(shù)次,100度干烤15分鐘,然后高壓滅菌除去depc.我們實(shí)驗(yàn)室一直是用170度考4小時(shí),且不準(zhǔn)離人,不準(zhǔn)過(guò)夜,可能是怕烤箱長(zhǎng)時(shí)間高溫,線路老化會(huì)發(fā)生危險(xiǎn)吧 提取RNA所用的槍頭，EP管。直接高壓烘干即可。如果用0.1％DEPC處理，要在DEPC配置后振搖1小時(shí)后再浸泡槍頭，EP管方有效。我做的都是將槍頭泡在配制好的depc中，搖振過(guò)夜，然后倒掉depc注意要到干凈，再高壓，為了防止仍殘留液體可120度干烤一會(huì) A.對(duì)于提取RNA來(lái)說(shuō),我認(rèn)為關(guān)鍵的一點(diǎn)在于實(shí)驗(yàn)器材的準(zhǔn)備.包括從最初的標(biāo)本的制備,保存,以及之后的試劑的準(zhǔn)備,勻漿器,鑷子,tip頭的去除RNase處理,尤其是去除RNase的DEPC處理步驟 B.您在處死大鼠前,先準(zhǔn)備好干凈的凍存管(用1.5ml的Ep管也可以,就是后面您在從液氮中取出的時(shí)候容易爆,您的注意安全),然后將去除的骨骼肌立即用干凈的剪刀分成半顆到一顆黃豆大小,裝入凍存管后立即投入液氮保存.個(gè)人認(rèn)為在這里使用裝標(biāo)本的管子沒(méi)必要用DEPC處理 C.在提取RNA之前,將試劑(TRIzol)和器械(tip頭,鑷子,勻漿器)都準(zhǔn)備好 D.從液氮取出標(biāo)本后,立即轉(zhuǎn)移進(jìn)入事先加入TRIzol的勻漿器內(nèi)(最好置冰上操作),立即勻漿,一直到標(biāo)本完全碾磨碎,這個(gè)時(shí)候TRIzol液體成渾濁狀,而且勻漿器的壁上沒(méi)有太多的黏附組織,然后將TRIzol轉(zhuǎn)出,繼續(xù)后續(xù)的步驟. 1 Rnase是一種蛋白酶，能夠降解RNA。 2我們的手上皮膚上有很多，應(yīng)該是對(duì)我們的身體起保護(hù)作用。保護(hù)不被RNA病毒感染？或者什么的。 3 這個(gè)酶高效穩(wěn)定。要么在DEPC水中處理n小時(shí)，要么在160度高溫烘烤6小時(shí)。此酶才會(huì)失效。 4 所謂DEPC，是一種叫做焦碳酸二乙酯的東西。有毒啊。所謂DEPC水，一般指兩種狀態(tài)，a，配制 好未消毒；b，配制好已消毒。通過(guò)高壓消毒，該物質(zhì)會(huì)降解，從而無(wú)毒。 1 無(wú)菌蒸餾水中加入0.1%(v/v)焦碳酸二乙酯（DEPC），室溫?cái)嚢?小時(shí)以上至完全溶解，高壓滅菌20分鐘，冷卻備用。這個(gè)是DEPC水的b狀態(tài)。 2 如果你要用DEPC水處理Tips等等東東，那么就要用高壓前的水，即DEPC水的a狀態(tài)。把槍頭管子等完全浸泡至少8小時(shí)，我一般都是過(guò)夜的，或者平時(shí)就泡在里面?zhèn)溆谩?br /> RNA提取必須創(chuàng)造無(wú)RNase的環(huán)境，所有儀器與試劑均按照以下方法進(jìn)行處理 ：研缽、研棒、藥匙、玻璃器皿等需在180℃烘干4h以上； 電泳槽、膠板、梳子、用0.1 %～0.2%DEPC水處理過(guò)夜或者用洗滌靈清洗干凈后用0.5%的SDS (Sodium dodecyl sulfate，抑制RNase的活性)浸泡過(guò)夜，然后用ddH2O沖洗干凈，晾干備用；離心管，槍頭等塑料器皿要用0.1%～0.2%DEPC水處理之后(DEPC有致癌之嫌，須小心操作)。37℃保溫12h以上，然后高壓滅菌，滅活DEPC ( Diethypyrocarbonate )；溶液都需用經(jīng)DEPC處理過(guò)的水配置， RNA提取的所有操作應(yīng)盡可能在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行。 我們研究所里提RNA用的槍頭和EP管都是高壓兩遍的，沒(méi)有用DEPC水處理。 1、 有滅菌過(guò)的DEPC水，這一般是用來(lái)配75%乙醇用，因?yàn)橐掖既舾邏簻缇鷷?huì)揮發(fā)，所以乙醇是新開(kāi)封專用的。 2、 沒(méi)有經(jīng)高壓滅菌的DEPC水，這主要是用于配你提RNA所用的其他試劑（所說(shuō)的試劑是可以經(jīng)高壓滅菌的），總的來(lái)說(shuō)，都得經(jīng)過(guò)高壓滅菌，目的就是要去除DEPC，以防止它以隨后實(shí)驗(yàn)的干擾。 3、 DEPC處理水：無(wú)菌蒸餾水中加入0.1%(v/v)焦碳酸二乙酯（DEPC），室溫?cái)嚢?小時(shí)以上，121 度高壓滅菌20分鐘，冷卻備用。 凡是不能用高溫烘烤的材料如塑料容器等皆可用0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液處理,再用蒸餾水沖凈。DEPC是RNA酶的化學(xué)修飾劑,它和RNA酶的活性基團(tuán)組氨酸的咪唑環(huán)反應(yīng)而抑制酶活性。DEPC與氨水溶液混合會(huì)產(chǎn)生致癌物,因而使用時(shí)需小心。試驗(yàn)所用試劑也可用DEPC處理,加入DEPC至0.1%濃度,然后劇烈振蕩10分鐘,再煮沸15分鐘或高壓滅菌以消除殘存的DEPC,否則DEPC也能和腺嘌呤作用而破壞mRNA活性。但DEPC能與胺和巰基反應(yīng),因而含Tris和DTT的試劑不能用DEPC處理。Tris溶液可用DEPC處理的水配制然后高壓滅菌。配制的溶液如不能高壓滅菌,可用DEPC處理水配制,并盡可能用未曾開(kāi)封的試劑. 為啥在28s之后還是有影影約約的片斷？和模糊的smear？ 這都與非變性電泳方式有關(guān)。RNA 的電泳，嚴(yán)格講是要使用變性電泳的，我們平時(shí)所知道的 RNA 電泳的知識(shí)，實(shí)際上都是由變性電泳獲得的。但因?yàn)榉亲冃噪娪緦?shí)在是太方便了，同時(shí)，就一般檢測(cè)而言，完全可以替代變性電泳，所以我們?nèi)粘z測(cè)就都使用非變性電泳了。 電泳時(shí)間太長(zhǎng)了容易產(chǎn)生降解。最好是在120V左右。操作的時(shí)候有沒(méi)有注意戴口罩和手套，注意，手套要經(jīng)常換，不要太節(jié)約了。那樣也會(huì)影響RNA的質(zhì)量。無(wú)論你是提什么RNA只要是用異丙醇沉淀的，都得用75％的酒精洗滌一次。 1 樣品不要太多，抽提務(wù)必充分，室溫放置5min； 2 200ul氯仿 劇烈振蕩20s，室溫放置2－15min； 3 13000g 離心 15min; 4 取上層水相,一般400-450ul就足夠了，千萬(wàn)不要貪多！*** 5 加入500ul異丙醇 搖勻，室溫放置10min； 6 12000g 離心 10min； 7 75％乙醇 1000ul 洗滌沉淀； 8 7500g 離心 5min；（12000轉(zhuǎn)速太高了吧，沉淀不容易溶解的） 9 棄乙醇，吸干凈殘余的微量乙醇， 室溫干燥3－5min；（時(shí)間太久沉淀不易溶解） 10 適量DEPC水溶解沉淀。 電泳的上樣量1ug，電泳buffer用DEPC處理的水配制，電泳時(shí)間不要太久，95V，10－15min足夠了。 建議跑RNA電泳。先用2％瓊脂糖膠，若分離效果不好，可用甲醛變性膠。在上樣緩沖液中注意加入RNA酶抑制劑。注意觀察帶形，質(zhì)量較好的RNA亮度 。28S:18S應(yīng)為2:1。還要注意觀察，在加樣孔或剛出加樣孔附近，有沒(méi)有帶， 若有，可能為基因組DNA污染。 OD值只有1.5，可能為基因組DNA污染。參考一下分子克隆3。上面有OD值與 污染DNA的關(guān)系。建議，酚氯仿抽提后，上清可少吸一些。提取后的RNA樣品可用無(wú)RNA酶的DNA酶消化一下。注意該酶的buffer中有一種物質(zhì)在OD260有吸光度，應(yīng)嚴(yán)格按照其protocol操作，減少誤差。 只要用DEPC處理過(guò)的水，打開(kāi)一瓶新的無(wú)水乙醇（或者專用于RNA的，即只用處理過(guò)的槍頭取過(guò)乙醇的）配就可以了。DEPC高溫高壓時(shí)變成CO2和水，再加上乙醇也很容易氣化，可能是因?yàn)橛袣怏w產(chǎn)生吧，如果蓋子太緊容易發(fā)生瓶子破掉的事情。（我還從來(lái)沒(méi)有聽(tīng)說(shuō)過(guò)把乙醇高溫滅菌過(guò)）而且，濕熱滅菌本身不足以去除RNA酶，所以我覺(jué)得有時(shí)候，滅菌可能反而引入RNA酶污染也不一定哦 75%的乙醇用于提取RNA 時(shí)最好還是現(xiàn)用現(xiàn)配，乙醇最好是新的且以后不要用于其他方面，也就是留一瓶專門用于提取RNA。DEPC一般高壓滅菌30分鐘就可以了！ 75%乙醇：滅菌后的千分之一DEPC水25ml+75ml無(wú)水乙醇.配好后裝入高溫烘烤的玻璃瓶中（160干烘四小時(shí)），或塑料器皿的用千分之一的DEPC泡12小時(shí)以上再滅30分鐘，存放于低溫冰箱4度保存!!! |
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