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1樓 2017-05-02 15:58:24

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西門吹雪170: 金幣+1, 鼓勵回帖交流 2017-05-02 19:27:40

有些植物它本身RNA含量會比較高，建議降低你的番茄葉片上樣量，從10MG,20，40，60，80MG做個(gè)梯度。樣品量如果太高，就會使RNA降解。

采菊東籬下，悠然見南山。

2樓2017-05-02 16:39:40

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ufolt16(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+1, 鼓勵回帖交流 2017-05-04 16:36:41

引用回帖:

5樓: Originally posted by ufolt16 at 2017-05-02 17:10:11
梯度的話不太現(xiàn)實(shí)…我是用研缽研磨再用小勺收集到ep管，擔(dān)心液氮干了會解凍造成降解，這一步都是快了再快的收集，損失其實(shí)是蠻大的，所以每次樣品都是過量研磨的怕?lián)p失太大，一般都是收集的差不多到ep管的0.1ml那就 ...

你不能怕浪費(fèi)的呀，液氮10幾塊錢一公斤，1MLtrizol都10幾塊錢那，磨的時(shí)候用剪刀把葉片剪成小片，大約1克，液氮倒?jié)M研磨，沿壁磨。液氮到個(gè)2.3次滿，就能磨成粉末了。液氮多了RNA不易降解，液氮少了就降解。

采菊東籬下，悠然見南山。

6樓2017-05-03 08:25:47

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ufolt16(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+3, 鼓勵回帖交流 2017-05-04 16:37:21

可以說你多次提取的番茄葉片的RNA都有不同程度降解，第一次降解的特別嚴(yán)重，植物RNA中含有大量的多糖多酚，次生代謝物質(zhì)以及大量的RNase，RNase活性很強(qiáng)，在整個(gè)試驗(yàn)過程中，無論內(nèi)源RNase還是外源RNase即使微量都會使提取的RNA發(fā)生降解，酚類物質(zhì)
在細(xì)胞破碎時(shí)被釋放出來，被氧化后可以與核酸不可逆地結(jié)合導(dǎo)致RNA的活性喪失，降低RNA的質(zhì)量。而多糖是影響RNA提取的另一個(gè)難題，多糖在水中的理化性質(zhì)與RNA相似，在提取過程中往往會與RNA形成難溶的膠狀物共同沉淀下來，常規(guī)提取方法難以將它們分開，而且在除去多糖的同時(shí)RNA也會被帶走，造成RNA產(chǎn)量的降低。因此，在RNA提取過程中要抑制RNase活性、克服次生代謝物質(zhì)的干擾，從而得到質(zhì)量較好、純度較高的RNA。
1、在提取的過程中最好使用提取植物RNA專用試劑，比如RNAiso for Polysaccharide-rich Plant Tissue，CTAB法，pvp法，總之關(guān)于植物提取的方法，網(wǎng)上一搜一大把。
2、提取的過程也要注意使用的裂解Buffer用量，用量太少，會導(dǎo)致RNA降解，用量過多，洗滌不充分，會導(dǎo)致高鹽、酚類等殘留，RNA純度不好，抑制后續(xù)PCR的擴(kuò)增。其實(shí)番茄葉片還是很好提取的材料。
3、提取優(yōu)質(zhì)的RNA標(biāo)準(zhǔn)，見下圖

珍惜生命

8樓2017-05-03 08:46:28

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wenting9999

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ufolt16(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+1, 鼓勵回帖交流 2017-05-04 16:36:59

引用回帖:

8樓: Originally posted by wenting9999 at 2017-05-03 08:46:28
可以說你多次提取的番茄葉片的RNA都有不同程度降解，第一次降解的特別嚴(yán)重，植物RNA中含有大量的多糖多酚，次生代謝物質(zhì)以及大量的RNase，RNase活性很強(qiáng)，在整個(gè)試驗(yàn)過程中，無論內(nèi)源RNase還是外源RNase即使微量都會 ...

完整番茄葉片的瓊脂糖凝膠電泳圖

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2017-05-03 08:52:24, 23.18 K

珍惜生命

9樓2017-05-03 08:52:56

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2樓: Originally posted by 781055707 at 2017-05-02 16:39:40
有些植物它本身RNA含量會比較高，建議降低你的番茄葉片上樣量，從10MG,20，40，60，80MG做個(gè)梯度。樣品量如果太高，就會使RNA降解。

請問上樣量是什么意思？您看我理解對嗎？trizol的比例是50-100mg：1ml，您的意思是不是指我的葉片按10.20.40…mg還是加1ml trizol來算，請問是這個(gè)意思嗎

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3樓2017-05-02 16:53:04

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3樓: Originally posted by ufolt16 at 2017-05-02 16:53:04
請問上樣量是什么意思？您看我理解對嗎？trizol的比例是50-100mg：1ml，您的意思是不是指我的葉片按10.20.40…mg還是加1ml trizol來算，請問是這個(gè)意思嗎
...

恩，是的。

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4樓2017-05-02 16:57:01

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4樓: Originally posted by 781055707 at 2017-05-02 16:57:01
恩，是的。...

梯度的話不太現(xiàn)實(shí)…我是用研缽研磨再用小勺收集到ep管，擔(dān)心液氮干了會解凍造成降解，這一步都是快了再快的收集，損失其實(shí)是蠻大的，所以每次樣品都是過量研磨的怕?lián)p失太大，一般都是收集的差不多到ep管的0.1ml那就加trizol了…

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5樓2017-05-02 17:10:11

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可以用試劑盒提取RNA，現(xiàn)在很多試劑盒都能夠滿足要求的，也不貴

路漫漫其修遠(yuǎn)兮，吾將上下而求索

7樓2017-05-03 08:35:55

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首先要明確，RNA并沒有想象中的那么容易降解，前提是規(guī)范操作，環(huán)境滿足要求，試劑無污染。這幾點(diǎn)應(yīng)該都很容易做到。戴口罩換手套，少走動，干凈整潔，手法嫻熟。
從你的提取結(jié)果可以看出，后來的比之前的效果好很多，可以說越來越好了。
插一句，EB染色一般推薦15分鐘，但是不是絕對的，先配置的可以時(shí)間短一點(diǎn)，用時(shí)間長的多染一會。要達(dá)到什么樣的目的，并不是看檢測的條帶是不是都很亮，而是要看Marker，看Marker的條帶有亮暗之分，這樣才能比較容易或者說是準(zhǔn)確的估算樣品的量。不知道你是否理解�？梢宰约好饕幌拢瑢�(shí)驗(yàn)幾次就知道多少時(shí)間比較合適。
然后，提取RNA并不是材料的量多就能提出來的RNA就多，第一步很重要，研磨要充分，裂解要到位，細(xì)胞必須能夠盡量多的釋放出來RNA才能之后收集到更多的RNA。
　最后，植物葉片是比較容易提取RNA的，選那些嫩的，一般都能滿足熒光的要求。做之前準(zhǔn)確定量RNA之后會省很多事。
提取RNA也算是比較常規(guī)的操作手法，多練練手法好了自然就好了。加油。