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餓的神啊

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求哪位大俠給設(shè)計一對引物來擴(kuò)增全長（3512bp），我已經(jīng)做了2對引物了，都做了溫度梯度，然而都沒有任何條帶
ACACGTACGTTGTGAGTTGTGACCACTACTTTCCCACAAAGAATTTTTTTTTTTTTTCCTAAAAATAAAAAAGATCTCATTTCTATAAGTTGTTTTAGTTTGATTTTACTTGCAGAAGAAAATTGAAGACATGGGAACTGAGGATCATCACCACCAGCATCATCATTCGGACACAGAGGTTCTTGGCAACGAGAGGATCCCGTACAGTGGTCCGCTAAGCGGCCCTTTGAACAAGAGAGTTGGCAGGAAGAGCACCAAGTTTAATTTGGCGACGGAATCAAGCTCAGGCTCGTCACCTCACGATGAGCCTTACGTTGAGATCACACTCGACGTCCGTGACGACTCGGTGGCTGTTCACAGCGTTAAGGCCGCTGGTGGGGATCATAGTAATCTTCAGGAAGATCCTGAGATTACTTTACTTGCAAAAGGGTTAGAGAAAAGGTCAACTTCTTTTGGTTCCAGTGTTGCTAGAACGGCTTCCGCGAAAATCAGGCAGGTGTCTCAAGAGCTCAAGCGCTTGGCTTCCTTTGCGAAGAAGCCTCAGCCGCCTGCCCGGTTTGATAGGAACAAGTCTGCTGCAGCTTATGCTTTGAAGGGGCTCAAGTTCATTAGCAAGACTGATGGTGGTGCTGGTTGGGCTAATGTTGAGAAGCGATTTGATGAAATAACCGCATCTACTAATGGGGTCTTGCCTCGAGCTCGCTTTGGCGAATGCATAGGAATGAACAAGGACTCGAAGGATTTCGCTGTTGAGTTGTTTGATGCTCTTACTCGGAGACGTAATATTCAAGGGGATACAATCACTAAGGATCAGCTAAGAGAGTTTTGGGATCAGATCTCTGATCAGAGTTTTGATTCCAGGCTTCAAACTTTCTTTGACATGGTTGATAAAGATGCAGATGGCAGAATCACGGAAGATGAAGTCAGAGAGATTATCACTCTCAGTGCTTCAGCAAACAAGCTCTCAAATATCCAGAAGCAAGCAGAGGAATATGCAGCTCTTATTATGGAAGAATTGGATCCTGACCATCTCGGATACATCATGATAGACAACCTGGAAATGCTTCTGTTACAAGCACCGGCGCAATCTGTTAAAGGTGGTGAGAGTCGAAACTTGAGCCACATGTTGAGCCAGAAGCTGAAGCCTACACAATTTGACAACCCAATTAGGAGATGCTGCGACAGCACCATGTACTTTTTACTGGACAATTGGCAAAGGGTGTGGGTGATGGCACAGTGGATTGGAGTGATGGCAGGGCTATTTACATACAAATACATTCAGTATAAAAACAGAGCTGCATTTGAAGTAATGGGACACTGCGTGTGCATGGCCAAAGGTGCTGCTGAGACGCTAAAATTCAACATGGCTCTGATTTTATTACCCGTCTGTCGAAACACCATTACATGGCTCAGAAACAAGACCAAACTCAGTGGTGTTGTTCCATTTGATGACAACCTCAATTTCCACAAGGTGATAGCAGTTGGAATCTCAATTGGGGTCGGAATACATGCTATTTCACATTTAGCATGCGATTTCCCTCGGCTTATAAATGCAAGTGAAGAGAAGTATGAGCCAATGGAGCCATATTTTGGGGATCAGCCCAAAAATTACTGGCATTTTGTGAAGTCAGTAGAAGGGGTAACTGGGATTGTGATGGTTGTTCTGATGGCTATCGCCTTCACACTTGCAACCCCATGGTTCCGGAGAAACAAGCTCAATTTGCCAAAGCCGTTAAAGAAGCTCACTGGGTTCAATGCCTTTTGGTATTCTCATCACCTTTTTGTCATCGTTTACACCCTGCTCATTGTGCATGGCCAATACCTTTACTTGACCAAAAAATGGTACAAGAAGACGACATGGATGTACTTGGCAATTCCAATTTGTCTTTATGCCACTGAGCGGTTGATTAGGGCACTGAGGTCAAGCATTAAGGCAGTTTCCATACAAAAGGTGGCTGTTTATCCTGGAAATGTGCTGGCTCTTCACATGTCAAAGCCAGATAGATTCAGATACAAGAGTGGGCAGTACATGTTTGTCAATTGTGCTGCTGTGTCCCCATTCGAATGGCACCCATTTTCAATAACTTCTGCCCCGGATGATGACTACCTCAGTGTTCACATTAGAACTCTTGGTGACTGGACTCGTCAACTCAGAACAGTTTTCTCAGAGGTATGCCGACCACCTCCAAACGGAATAAGTGGACTCCTCCGAGCCGAGGGACATAACAATCCTGATTTTCCTAGAGTTTTGATTGACGGTCCATATGGAGCTCCAGCACAAGACTACAAAGAGTATGAGGTGGTTTTATTAGTTGGTCTGGGAATTGGAGCAACTCCGATGATCAGCATTGTTAAAGACATAGTGAACAACATGAAAGCCATAGAGGAAGAAGAAGAAAATGATTTAGAAAACGGTCGTGACACCGGCGTTAACACAACATCATCATCATCGACAACAACCACGAGCCCTTCTTCTTCTGGACACAGAAGAAGGGACCAATTCAGGACAAGAAGAGCATACTTCTATTGGGTTACAAGAGAGCAAGGCTCGTTCGATTGGTTTAAGGGAGTGATGAATGAGGTGGCTGAATTGGACCACAACAATGTCATAGAGCTTCACAATTACTGCACCAGTGTTTATGAAGAAGGTGATGCTCGCTCAGCTCTCATTGCCATGCTTCAGTCCCTCAATCACGCCAAGAATGGCGTTGACGTTGTCTCTGGAACACGCGTTAAGTCACATTTCGCCAAGCCTAATTGGCGCAATGTGTACAAACGCGTTGCTCTCAATCACCCTGATTCTAGAGTTGGTGTTTTCTATTGCGGGGCACCGGCACTGACAAAAGAGCTACGACACCTAGCTTTGGATTTCTCTCACAAGACAAGCACCAAGTTTGATTTCCATAAAGAAAACTTCTAGATCAAGTCCCTCCTGATTTCCACCATTATATATCATCTCTTCCACTCCGTTTTCTCGTACAAAGCCTGTGGCATGGCCCACTGGCCCTTATGTTTATAGAAAAATCATATCAATATTTGTTTGGTACCCAGTTGATTTTGCTGCAAAATCACTAATAGAGAGCATTAGAAATATCAAGCGGACAAAGGTTGGTGGGTAGTTGATATCAAGGCCACACCACACTGGACACACAACACATGGCAAGGGAGATATAGGCCGAAAAAGGGGTTTAGCAAAAAAGTCATGCTCAGCCATTTCCTTTTGTTAAAAGTTGTGGTCCAAGCCAATAATTTTGTGAGAAATAGTAATAATGGCAGCCTGGCAGCCACCACTAATAATGGCAGCCTGGCAGCCACCACCAACTCAGTCCTTAACAGCCAAATGTAAAAGGGTTTTTGTTTTGTTTTCTTTTCTTTTTGGTTGGAGTAATTTGTTGTTTTATTTGATTAATTAAAGTTGCGATGTCAATTGAATGGGGTCGTAAGCCCTTTAAAATGTAAGTATGTATTGAATAATTAGTTCGGAGTACACTTTACCCAATTTCTTATGTTTC

這是我之前的引物
F1：ACACGTACGTTGTGA
R1：GAAACATAAGAAATTGGG

F2：ACACGTACGTTGTGAGTTGTGACCACTACTTTCCCACAAA
R2：GAAACATAAGAAATTGGGTAAAGTGTACTCCGAACTAATT

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1樓 2017-05-05 22:15:30

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2樓2017-05-05 22:21:49

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4樓2017-05-05 23:42:26

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5樓2017-05-05 23:49:18

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餓的神啊: 金幣+10, ★★★很有幫助 2017-05-10 17:14:23

引物和模板都沒問題的情況下，調(diào)整溫度有時作用不大，最好換個酶試試，效果立竿見影

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happy

7樓2017-05-06 11:55:38

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3樓: Originally posted by 安志達(dá)天下 at 2017-05-05 23:16:55
第二對引物應(yīng)該可以擴(kuò)增出來，建議使用高保真酶擴(kuò)增，延伸時間提高到三分鐘試試

已使用takara的LA taq，延伸時間4分鐘，依然只有引物二聚體，模板沒有問題，是之前RACE時的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，并且做了正對照，條帶清晰

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11樓2017-05-07 20:50:39

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引用回帖:

9樓: Originally posted by 餓的神啊 at 2017-05-07 15:12:24
模板沒有問題，用的模板是之前做RACE的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，我稀釋了用的，而且我拿別的引物做了對照，條帶很亮...

BLAST沒有找到別的接近全長的相似序列，除非樣本來源跟參考序列一樣，否則建議先從700-2300bp區(qū)間，甚至1300-2000bp區(qū)間，設(shè)計一對引物，最好是在保守區(qū)的，擴(kuò)增測序，看看跟其他更接近，可能樣本的跟你目前的參考序列不相似，這樣選擇目前的引物就不大可能從cDNA中擴(kuò)增到目的序列。

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12樓2017-05-07 20:52:29

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6樓2017-05-06 10:55:29

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引用回帖:

我是想先看看有沒有條帶，再換成高保真酶的，延伸時間都提到4分鐘了，什么條帶也沒有啊

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8樓2017-05-07 15:11:17

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引用回帖:

5樓: Originally posted by Cruiser肖 at 2017-05-05 23:49:18
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模板沒有問題，用的模板是之前做RACE的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，我稀釋了用的，而且我拿別的引物做了對照，條帶很亮

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9樓2017-05-07 15:12:24

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西門吹雪170: 金幣+1, 鼓勵回帖交流 2017-05-07 22:18:05

換phusion polymerase之類具有長片段擴(kuò)增能力的酶，普通的taq之類沒這能力。而且你的PCR體系也要注意擴(kuò)增時間，別還在合成片段呢，溫度就開始95度進(jìn)行下一個循環(huán)了

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10樓2017-05-07 15:46:11

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