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FionaD新蟲 (初入文壇)
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[求助]
板子長不出菌啊好著急 已有3人參與
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我們實驗室三個人做基因克隆，一個用的pEASY-blunt克隆載體，用的卡納的板子，我們倆用的blunt E1表達(dá)載體，用的氨芐的板子，但是連接轉(zhuǎn)化涂平板之后都長不出菌是為啥��！昨天用質(zhì)粒做了對照，質(zhì)粒就長了滿滿一板子，說明感受態(tài)沒問題啊，操作用的都是同一套，而且三個人誰做都長不出來，實在想不出來是哪里有問題啊……各位師兄師姐幫幫忙啊 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
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sherlock0088
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5樓2017-05-31 18:57:46
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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3樓2017-05-31 12:54:02
4樓2017-05-31 14:31:45
sherlock0088
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請詳細(xì)描述你克隆的過程，包括所用的體系（包括但不限于PCR體系，連接體系），克隆片段長度，產(chǎn)物濃度，A260/A260，A260/A230，nanodrop峰圖或吸光度曲線，溶解或回收用的是什么 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
2樓2017-05-31 11:42:58
FionaD
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PCR跑的是20μ升體系，我的片段長度1600bp，用的全式金的酶，然后用的生工的回收試劑盒，回收產(chǎn)物跑電泳，Maker點2.5μ升，條帶亮度和Maker差不多，然后連接用的blunt E1載體，載體1μ升＋水1.5＋回收產(chǎn)物2.5μ升，PCR里25℃孵育30min，然后用的trans T1感受態(tài)，把連接產(chǎn)物全部加進(jìn)去，冰上30min，42℃熱激30s，冰上3min，加SOC，210rmp，37℃一小時，然后6000離心一分鐘，留100μ升涂板子，用的氨芐的，但是好幾次了，要不就是只長一兩個菌，還是假陽性，要不就是一個都不長…和我一起的兩個同學(xué)，我們做的基因不同，操作一樣，也是不長菌…感受態(tài)用質(zhì)粒做過對照，質(zhì)粒長了滿滿一板子…好絕望啊… 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
6樓2017-06-01 10:39:09
FionaD
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但是我們實在不知道為啥會連接不成功啊…都是按著說明書上和師姐教的操作的，看了好多次不長菌的板子了，心態(tài)都要崩了…我還有七個基因的原核要做，還要復(fù)習(xí)考研，真的是有點焦啊… 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
7樓2017-06-01 10:43:36
早安wanan
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這個E1就是挺有意思，我也做過，就長五六個菌，感覺根本就不是，都要絕望了，但是這么幾個就都是對的。建議你連的時候不要加水，直接4微產(chǎn)物。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
8樓2017-06-01 10:47:19
FionaD
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- 專業(yè): 蔬菜學(xué)與瓜果學(xué)
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關(guān)鍵是我們每次長兩三個都算多了，還很多是假陽性，我總共做7個基因，前面四五個都很正常，就這段時間，板子怎么長都沒有菌，昨天我同學(xué)又做了連接，用的是4μ升回收產(chǎn)物1μ升載體，今天早上板子上還是什么都沒長。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
9樓2017-06-01 12:01:05
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10樓2017-06-01 15:03:49
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