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[求助]
目的蛋白將His tag包裹，蛋白不與鎳柱結(jié)合？急求純化蛋白的大神指點(diǎn)！ 已有2人參與
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| 如題，載體用peasy-E1，前段帶6個(gè)His標(biāo)簽，因不掛柱，又在后端加6個(gè)His標(biāo)簽，測(cè)序正確，能夠表達(dá)且跑蛋白膠表達(dá)量很高，酶活也有，就是過鎳住時(shí)，結(jié)合不上去，目標(biāo)蛋白在流穿的bunding buffer 中，分析是：His tag被包裹在目的蛋白里，如何解決這個(gè)問題？？？得不到高純度的蛋白，實(shí)驗(yàn)被迫中止，急求過鎳柱的高手指點(diǎn)！��！ |
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
陽光雨露118: 金幣+50, ★★★很有幫助 2017-08-07 17:42:01
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
陽光雨露118: 金幣+50, ★★★很有幫助 2017-08-07 17:42:01
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（1）超聲的功率不對(duì)(太大，蛋白炭化，太小，蛋白沒有釋放) 策略：改變超聲功率，并在超聲前加入溶菌酶。 （2）樣品或者是結(jié)合緩沖液不正確： 策略：檢測(cè)pH 及樣品和結(jié)合緩沖液的組成份（EDTA等）。確保在溶液 中鰲合劑或強(qiáng)還原劑的濃度及起始咪唑的濃度不是太高。 · （3）組氨酸的標(biāo)簽沒有完全的暴露 策略：在變性條件下(用8M脲，6M鹽酸胍,1%SDS)并加入1-2mMDTT 進(jìn)行純化。 （4）His標(biāo)簽丟失,策略1：WB或者anti-his的抗體檢查His是否表達(dá)，上游構(gòu)建，改變his-tag的位(C-terminal or N-terminal)，必要時(shí)增加his個(gè)數(shù)(常用6-10個(gè))。策略2：孵育的時(shí)間不夠，降低流速和增加孵育的時(shí)間。策略3：改變螯合的金屬離子，尋找到最佳的結(jié)合金屬離子。 Ni2+通常是從宿主細(xì)胞蛋白中純化大多數(shù)(組氨酸)6 標(biāo)記的重組蛋白質(zhì)的首選金屬離子，也是一般最常用的離子。蛋白和金屬離子之間的結(jié)合強(qiáng)度受幾種因素影響，包括長度、位置、親和標(biāo)記在蛋白的暴露程度、所用離子的類型、以及緩沖液的pH，因此一些蛋白用其他離子可能更容易地進(jìn)行純化而不用Ni2+。可以利用Hitrap IMACHP來篩選不同的金屬離子，具體應(yīng)用實(shí)例請(qǐng)參考《Recombinant Protein Purification Handbook》。 |
6樓2017-08-06 23:39:25
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原核表達(dá)很多蛋白都會(huì)過量表達(dá)。蛋白短時(shí)間內(nèi)大量表達(dá)而來不及正確折疊，你先把你現(xiàn)有的表達(dá)時(shí)間縮小一倍看看。如果還不能解決，你只能想辦法把把結(jié)構(gòu)打開，再重新折疊。對(duì)了，你的蛋白不掛柱，但能溶解嗎？有沒有沉淀啥的？ 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
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8樓2017-08-07 08:01:37
evpmf
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10樓2017-08-07 08:32:57
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2樓2017-08-06 16:52:43
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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可以變性純化，得到蛋白后再復(fù)性。用酶活來標(biāo)記復(fù)性蛋白比率。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
7樓2017-08-07 06:08:00
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不好意思，上面說的把蛋白當(dāng)成原核的來處理了。如果是原核表達(dá)，你可以參照一下，如果不是你就變性一下，再復(fù)性。實(shí)在不行你就重新構(gòu)建到一個(gè)新載體中試試。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
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9樓2017-08-07 08:09:59
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