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片段連了半年了，死活連不上，要看再不行就要延期了，求大神幫忙分析一下 已有3人參與
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首先我一共要連接三個片段，直接連接表達載體，這三個片段都屬于同一個基因家族，就是同源性不高，片段是pcr得到的（提取的研究材料全RNA反轉錄得到的cDNA），采用雙酶切的方法，選取的是sal1和BamH1兩個酶切位點，這兩個酶切位點在載體上離得很近，序列是（GTCGAC）TCTAGA（GGATTC），只間隔了6bp，不過我通過先用sal1酶切在用BamH1酶切的方法已經(jīng)連接上了兩個片段，這能說明我的載體酶切肯定是沒問題的吧？而且三個片段都是同一操作流程，也就是說我設計的引物也沒問題吧？片段酶切也沒問題吧？但是，第三個片段，也是最關鍵的片段，就是死活連不上去，連上那兩個片段其實就用了三個星期……本來我想著，因為原來的載體酶切后不好判斷酶切程度，我可以通過酶切已經(jīng)連上目的片段的重組質(zhì)粒，跑膠回收酶切好的載體來做連接，但是，重組質(zhì)粒，一切就碎，就跟pcr的引物二聚體似的，根本沒法回收，重新提了一批原始質(zhì)粒和片段做酶切，用50的體系，酶各加2，酶切4小時，跑膠發(fā)現(xiàn)，竟然也被切碎了，然后，減小酶量，各加1，發(fā)現(xiàn)還是碎了，是因為這次用的大體系酶切么？我之前酶切用的25的體系……求各位大神幫忙分析一下，描述比較混亂，我現(xiàn)在特別絕望…… @飛約瘋人院 @biostar2009 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
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