 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 5 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 1437 | 回復(fù): 6 | |||
| 當(dāng)前只顯示滿足指定條件的回帖，點擊這里查看本話題的所有回帖 | |||
孤單芭蕾527新蟲 (初入文壇)
|
[求助]
載體構(gòu)建 已有1人參與
|
||
|
我的一個亞細胞定位的載體，載體原本標(biāo)注的只有一個Bam HI的酶切位點，但是我用單酶切出來兩條帶，我不想重新修改目的基因的酶切位點了，請教大佬們，我用Age I和Bam HI雙酶切，然后給載體去磷酸化，再和我的用Age I和Bam HI酶切目的基因連接，可以么？ @youlinglyw @biostar2009 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
回復(fù)此樓» 猜你喜歡
不合理蛙科研實驗中的趣事：實驗器材的 “烏龍”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實驗中的趣事：和實驗材料的 “斗智斗勇”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
化學(xué)工程及工業(yè)化學(xué)論文潤色/翻譯怎么收費?
已經(jīng)有146人回復(fù)
-
蛋白質(zhì)檢測：精準分析，解鎖生物分子的密碼
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實驗之小鼠實驗：嚴謹設(shè)計，解析生命機制的重要載體
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實驗之重金屬檢測：精準篩查，守護健康與環(huán)境的防線
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實驗之“蛙測重金屬我背鍋三千”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實驗之“鼠逃三次我發(fā)三篇SCI”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
納米粒度分析
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
林科院林化所招收材料與化工專業(yè)碩士，坐標(biāo)南京
已經(jīng)有0人回復(fù)
孤單芭蕾527
新蟲 (初入文壇)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 27
- 帖子: 33
- 在線: 1.8小時
- 蟲號: 6504747
- 注冊: 2017-05-11
- 性別: MM
- 專業(yè): 作物分子育種
|
1、載體是別的實驗室拿來的，他們也用過Bam HI，說沒有問題，但我確實單用Bam HI切出了兩條帶。 2、Age I驗證過可以切開 3、我之前試過用Age I和Bam HI雙酶切，但是連接后，長得斑太多了，假陽性太多，所以我可不可以，雙酶切后在去磷酸化，防止兩端都是Bam HI的載體連接 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
3樓2018-05-16 20:31:07
【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
|
1. 不知道你原始載體是哪里來的，比如是跟人家要的還是實驗室以前構(gòu)建留下的，如果酶切結(jié)果與你的預(yù)期不一致，而你的預(yù)期是基于很確定的資料的話，最好（1）跟來源的人或者單位再確認一下載體的問題，看能不能更換更準確的載體；（2）送去測序，保證你的MCS區(qū)域或者你關(guān)心的那些關(guān)鍵區(qū)域的序列起碼是正確的，同時，不知道你的質(zhì)粒是否比如說經(jīng)過長時間保存之類的，你可以轉(zhuǎn)克隆感受態(tài)再挑斑多鑒定幾個，看看能不能得到酶切鑒定正確的克隆，然后再拿來用 2. 你說用Age I和BamH I酶切并且連接，這個本身和上面BamH I單酶切鑒定不正確沒有太直接的關(guān)系，只要你的Age I也能夠切開質(zhì)粒（不知道你用Age I驗證過沒有？），理論上就可以進行雙酶切連接，當(dāng)然，看你現(xiàn)在的情況可能載體上有兩個BamH I的位點，那加入Age I的位點位于這兩個Bam H I之間，雙酶切之后Age I位于小條帶你不要的那個小條帶上，這樣確實也不行，所以一定要用Age I驗證一次 |
2樓2018-05-16 19:21:34
|
把你的電泳圖發(fā)給他們，當(dāng)然你一定要保證你的酶切沒有問題 他們?nèi)绻龅臎]有問題，就讓他們把沒有問題的給你一份，這種載體骨架要是出問題，你后面的實驗就像埋了定時炸彈一樣 所以也建議對MCS區(qū)域測序，確定你目的片段插入的位點附近序列究竟是什么，是否正確 你連接后長斑假陽性多，這相對上面的問題來說又是另一個問題，可能跟你的連接體系、連接時間都有關(guān)系，從而造成高背景。一般雙酶切不需要去磷酸化，一般對于平末端連接或者單酶切連接才需要防止自連 最重要的還是建議你把載體搞清楚，可能你覺得再要一次不太容易或者不好意思，但還是硬著頭皮要個正確的吧，誰也保不準到底哪段序列出了問題，再次就是優(yōu)化你的連接體系，如果想去磷酸化處理防止自連不是不可以，去磷酸化本身也需要些優(yōu)化，而且增加你的操作步驟 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
4樓2018-05-17 09:25:58
|
不好意思，最后一個問題沒解釋清楚 你要是考慮是BamH I單位點造成自連，載體肯定是可以去磷酸化處理的，一般也是這么做的，但是，你的前段是雙位點，在這種假設(shè)的前提下，你片段即使連上去了，這個序列說實話也真是有問題的，即便你說可能是通過菌體自身的修復(fù)機制將片段的Age I末端和載體的BamH I末端連接了 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
5樓2018-05-17 09:31:32
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 一志愿中南化學(xué)337求調(diào)劑 +4 | niko- 2026-03-19 | 5/250 |
|
|---|---|---|---|---|
|
|
[考研] 265求調(diào)劑 +9 | 梁梁校校 2026-03-19 | 9/450 |
|
|
[考研] 招收調(diào)劑碩士 +4 | lidianxing 2026-03-19 | 12/600 |
|
|
|
[論文投稿]
申請回稿延期一個月，編輯同意了。但系統(tǒng)上的時間沒變，給編輯又寫郵件了，沒回復(fù)
 10+3
|
wangf9518 2026-03-17 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 生物學(xué)調(diào)劑招人�。�！ +3 | 山海天嵐 2026-03-17 | 4/200 |
|
|
|
[考博] 申博26年 +3 | 八6八68 2026-03-19 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 085601材料工程專碩求調(diào)劑 +10 | 慕寒mio 2026-03-16 | 10/500 |
|
|
|
[考研] 324分 085600材料化工求調(diào)劑 +3 | llllkkkhh 2026-03-18 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 化學(xué)求調(diào)劑 +3 | 臨澤境llllll 2026-03-17 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 0703化學(xué)調(diào)劑 +5 | pupcoco 2026-03-17 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 一志愿福大288有機化學(xué)，求調(diào)劑 +3 | 小木蟲200408204 2026-03-18 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 材料專碩306英一數(shù)二 +10 | z1z2z3879 2026-03-16 | 13/650 |
|
|
|
[考研] 0703化學(xué)336分求調(diào)劑 +6 | zbzihdhd 2026-03-15 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 268求調(diào)劑 +6 | 簡單點0 2026-03-17 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 308求調(diào)劑 +4 | 是Lupa啊 2026-03-16 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 材料工程專碩274一志愿211求調(diào)劑 +6 | 薛云鵬 2026-03-15 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 274求調(diào)劑 +5 | 時間點 2026-03-13 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 藥學(xué)383 求調(diào)劑 +3 | 藥學(xué)chy 2026-03-15 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 330求調(diào)劑 +3 | ?醬給調(diào)劑跪了 2026-03-13 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 266求調(diào)劑 +4 | 學(xué)員97LZgn 2026-03-13 | 4/200 |
|