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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 分子生物 » 綜合其他 » 畢赤酵母表達疏水蛋白
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肉肉肉.鐵蟲 (小有名氣)
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[求助]
畢赤酵母表達疏水蛋白 已有1人參與
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各位大神好，轉眼都要大二下學期了，但是蛋白還是沒表達出來，很是焦慮！懇請各位做過畢赤酵母表達蛋白的大神賜教！ 我要表達的是真菌當中的一種疏水蛋白，提取了真菌的RNA后反轉錄，從NCBI中獲得該蛋白的CDS區(qū)域之后設計引物從cDNA中PCR除了該蛋白的基因序列。 然后去除了它的自身信號肽，將它連到了ppic9k載體和pPICZA中，分別進行胞外和胞內表達，用的是EcoR1和Not1酶切位點。 ppic9k是將片段直接插入到這兩個酶切位點，pPICZA中為了防止移碼突變在目的片段的終止子后面通過引物設計加入了一個密碼子A。 這兩個表達載體都通過引物在蛋白的C端加了6XHis標簽，然后將表達載體分別用Sal1和Sac1線性化后電轉，篩選轉化子， 提取酵母基因組鑒定成功后誘導，誘導就是根據誘導手冊一步步來，然后跑了SDS-PAGE也做了Western，蛋白膠的話跟對照無差別，但是WB沒有做出來， WB的一抗是his標簽抗體，蛋白膠的話蛋白上清和破碎液都做了，都沒結果，現(xiàn)在不知道哪里出了問題�。�！快焦慮死了！好想退學��！老板天天催�。。� 我是真的沒有發(fā)現(xiàn)哪里有問題啊各位大神�。。樯秳e人表達一個蛋白都跟玩兒似的到我這里就這么難�。�！ 我都做了兩遍表達了好多批！就是沒有�。�！好想退學�。。。。。�！ 現(xiàn)在有個疑慮就是說表達蛋白的疏水性是不是會影響蛋白的檢測，可是查閱文獻有表達類似的疏水蛋白也是一樣直接取上清進行檢測并沒有做特殊處理 啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊�。。。≌娴氖遣粫隽税。。。。。。。�！跪求大神來相救！�。。。。。。。。。�！ |
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 蛋白表達純化鑒定精華 |
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3樓2016-01-16 19:01:21
肉肉肉.
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2樓2016-01-16 18:37:57
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4樓2016-01-16 19:23:46
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5樓2016-01-16 19:36:29
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