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小冀-版主 (著名寫手)
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[求助]
pMD-19T載體與目的片段的連接問題 已有6人參與
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之前計(jì)劃目的基因（3.6Kb）與pMD-19T進(jìn)行TA克隆連接，目的片段用primerstar高保真酶后加A連接，氨芐板生長，鑒定后發(fā)現(xiàn)是載體自連；后來用Taq酶PCR擴(kuò)增后直接與pMD-19T載體鏈接，最后發(fā)現(xiàn)還是自連的···發(fā)現(xiàn)這都不行后就進(jìn)行一步克隆（ClonExpressTM快速克隆技術(shù)），之前認(rèn)為在載體是線性的，就直接連了，但是沒有連上，氨芐平板上沒長；后來用以前構(gòu)建好的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切后進(jìn)行一步克隆，可是氨芐平板上還是沒有長···各位大神，求助··· 轉(zhuǎn)化條件： 感受態(tài)是自己用氯化鈣法做的，以前也是用它來做轉(zhuǎn)化，都可以的··· 熱擊90s后，37℃活化1h后，將轉(zhuǎn)化液濃縮全部涂平板··· |
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4樓2014-07-25 11:38:57
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