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孤單芭蕾527新蟲 (初入文壇)
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[求助]
載體構(gòu)建
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我的一個亞細(xì)胞定位的載體，載體原本標(biāo)注的只有一個Bam HI的酶切位點，但是我用單酶切出來兩條帶，我不想重新修改目的基因的酶切位點了，請教大佬們，我用Age I和Bam HI雙酶切，然后給載體去磷酸化，再和我的用Age I和Bam HI酶切目的基因連接，可以么？ @youlinglyw @biostar2009 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
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把你的電泳圖發(fā)給他們，當(dāng)然你一定要保證你的酶切沒有問題 他們?nèi)绻龅臎]有問題，就讓他們把沒有問題的給你一份，這種載體骨架要是出問題，你后面的實驗就像埋了定時炸彈一樣 所以也建議對MCS區(qū)域測序，確定你目的片段插入的位點附近序列究竟是什么，是否正確 你連接后長斑假陽性多，這相對上面的問題來說又是另一個問題，可能跟你的連接體系、連接時間都有關(guān)系，從而造成高背景。一般雙酶切不需要去磷酸化，一般對于平末端連接或者單酶切連接才需要防止自連 最重要的還是建議你把載體搞清楚，可能你覺得再要一次不太容易或者不好意思，但還是硬著頭皮要個正確的吧，誰也保不準(zhǔn)到底哪段序列出了問題，再次就是優(yōu)化你的連接體系，如果想去磷酸化處理防止自連不是不可以，去磷酸化本身也需要些優(yōu)化，而且增加你的操作步驟 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
4樓2018-05-17 09:25:58
【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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1. 不知道你原始載體是哪里來的，比如是跟人家要的還是實驗室以前構(gòu)建留下的，如果酶切結(jié)果與你的預(yù)期不一致，而你的預(yù)期是基于很確定的資料的話，最好（1）跟來源的人或者單位再確認(rèn)一下載體的問題，看能不能更換更準(zhǔn)確的載體；（2）送去測序，保證你的MCS區(qū)域或者你關(guān)心的那些關(guān)鍵區(qū)域的序列起碼是正確的，同時，不知道你的質(zhì)粒是否比如說經(jīng)過長時間保存之類的，你可以轉(zhuǎn)克隆感受態(tài)再挑斑多鑒定幾個，看看能不能得到酶切鑒定正確的克隆，然后再拿來用 2. 你說用Age I和BamH I酶切并且連接，這個本身和上面BamH I單酶切鑒定不正確沒有太直接的關(guān)系，只要你的Age I也能夠切開質(zhì)粒（不知道你用Age I驗證過沒有？），理論上就可以進(jìn)行雙酶切連接，當(dāng)然，看你現(xiàn)在的情況可能載體上有兩個BamH I的位點，那加入Age I的位點位于這兩個Bam H I之間，雙酶切之后Age I位于小條帶你不要的那個小條帶上，這樣確實也不行，所以一定要用Age I驗證一次 |
2樓2018-05-16 19:21:34
孤單芭蕾527
新蟲 (初入文壇)
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- 專業(yè): 作物分子育種
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1、載體是別的實驗室拿來的，他們也用過Bam HI，說沒有問題，但我確實單用Bam HI切出了兩條帶。 2、Age I驗證過可以切開 3、我之前試過用Age I和Bam HI雙酶切，但是連接后，長得斑太多了，假陽性太多，所以我可不可以，雙酶切后在去磷酸化，防止兩端都是Bam HI的載體連接 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
3樓2018-05-16 20:31:07
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不好意思，最后一個問題沒解釋清楚 你要是考慮是BamH I單位點造成自連，載體肯定是可以去磷酸化處理的，一般也是這么做的，但是，你的前段是雙位點，在這種假設(shè)的前提下，你片段即使連上去了，這個序列說實話也真是有問題的，即便你說可能是通過菌體自身的修復(fù)機制將片段的Age I末端和載體的BamH I末端連接了 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
5樓2018-05-17 09:31:32
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