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青檸檬PCR新蟲 (正式寫手)
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想問下有沒有人在設(shè)計引物時，以環(huán)裝質(zhì)粒為模板6300bp，幾乎要擴(kuò)增下來整個片段，然后引物r為61bp，gc含量62.3%，Tm99.8，f為41bp，gc含量53.7%，Tm86，然后用了高保真和pcr enhancer，結(jié)果有個1300左右的條帶， 想問下是什么問題 @biostar2009 @飛約瘋?cè)嗽?/u> @wizardfan @youlinglyw 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
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4樓2018-07-28 00:01:13
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為什么要搞這么長的引物？都是特異匹配的嗎？以環(huán)狀質(zhì)粒做定點突變，也是要擴(kuò)增下整個質(zhì)粒。并不難。你再摸索一下條件吧，1300說明引物退火到非目的序列了 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
2樓2018-07-27 23:55:29
青檸檬PCR
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3樓2018-07-28 00:00:35
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明白了，你加的6his或者其他酶切位點或保護(hù)堿基都不要算，Tm要以嚴(yán)格與模板堿基互補(bǔ)配對的靠近3'端計算，一般這段序列不超過30bp就夠了。我猜你程序退火高了。以質(zhì)粒做模板相比基因組是非常好擴(kuò)增的實驗，注意不要加太多質(zhì)粒模板吧 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
5樓2018-07-28 00:07:32
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