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一步一步教你做PCR 整天談?wù)摐y序，那測序里面關(guān)鍵的一環(huán)是什么呢？當(dāng)然是PCR了。呵呵，本次小編就寫給只會做分析而不會做實驗的的生物信息小伙伴們。很重要奧，所有的分析最終都要落到驗證上奧！ 一、實驗原理 PCR是體外人工選擇性擴(kuò)增DNA的一種方法，它類似于生物體內(nèi)DNA的復(fù)制。在生物體內(nèi)DNA復(fù)制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs；而體外PCR反應(yīng)同樣需要類似的成分，有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工設(shè)計的特定序列，實現(xiàn)對特定位置的擴(kuò)增；PCR Buffer提供一個反應(yīng)的緩沖環(huán)境；反應(yīng)過程同生物體內(nèi)一樣，DNA雙鏈打開，引物結(jié)合模板，延伸形成新鏈。而這些過程在生物體內(nèi)靠DNA解旋酶解鏈，而在體外在通過控制反應(yīng)溫度實現(xiàn)的。如常用94℃變性模板DNA打開雙鏈，在退火溫度處引物結(jié)合到模板上，最后在72℃完成延伸，并反復(fù)重復(fù)此過程即可實現(xiàn)對特定片段DNA的大量擴(kuò)增。到第三循環(huán)開始才產(chǎn)生出和靶DNA區(qū)段相同的DNA分子，進(jìn)一步循環(huán)地產(chǎn)生出靶DNA區(qū)段的指數(shù)加倍。 在擴(kuò)增后期,由于產(chǎn)物積累,使原來呈指數(shù)擴(kuò)增的反應(yīng)變成平坦的曲線,產(chǎn)物不再隨循環(huán)數(shù)而明顯上升,這稱為平臺效應(yīng)。平臺期(Plateau)會使原先由于錯配而產(chǎn)生的低濃度非特異性產(chǎn)物繼續(xù)大量擴(kuò)增，達(dá)到較高水平。因此，應(yīng)適當(dāng)調(diào)節(jié)循環(huán)次數(shù)，在平臺期前結(jié)束反應(yīng)，減少非特異性產(chǎn)物。到達(dá)平臺期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。 二、主要的成分 模板 1.模板可以是多種形式，主要包括基因組DNA、質(zhì)粒DNA、攜帶病毒的基因組DNA、PCR產(chǎn)物，cDNA等，但不能為RNA。對于不同類型的模板，其主要不同在于預(yù)變性的時間以及模板的量。一般對于大的基因組DNA預(yù)變性時間10min足夠，質(zhì)粒DNA2min、攜帶病毒的基因組DNA預(yù)變性2min、PCR產(chǎn)物預(yù)變性2min即可。 注意cDNA為單鏈DNA，但仍可做PCR的模板，只不過在第一輪循環(huán)時只有一個引物結(jié)合，合成另一條鏈。從第二輪開始，兩個引物均與特異位點結(jié)合，從而實現(xiàn)了與常規(guī)PCR的接軌。而同作為單鏈的RNA卻不能進(jìn)行PCR擴(kuò)增，原因就在于實現(xiàn)PCR反應(yīng)的是DNA聚合酶，只能特意識別DNA鏈。 2.對于模版的量來說，一般25ul體系DNA的質(zhì)量為50—100ng。對于基因組DNA由于其結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，提取的濃度也往往比較大，為防止?jié)舛冗^大對PCR造成影響，故需對提取的DNA進(jìn)行梯度稀釋。否則濃度過高則可能會引起非特異性擴(kuò)增。對于質(zhì)粒及PCR產(chǎn)物由于其結(jié)構(gòu)簡單，且提取濃度一般較低，則無需稀釋。 引物 １．一般引物用貯液濃度為10uM。對于剛合成的引物可以根據(jù)期管壁上的說明計算稀釋至10uM即可（一般引物說明上配制的濃度往往過高，所以必須稀釋至10uM才能利用實驗室最小刻度（0.5ul）的移液器取到）。另外引物一旦稀釋完畢，應(yīng)注意分裝小份，防止在用的過程中反復(fù)凍融引物而造成引物的失效。 2.一般25ul反應(yīng)中引物用量為0.5ul（終濃度要求為為0.1——1uM），若引物若放置時間比較長，則可以適當(dāng)增加引物的用量。引物用量過多，容易導(dǎo)致引物二聚體（電泳時位于前方不成條帶的小片段）的出現(xiàn)。 附： 1.引物稀釋的方法：配制時首先將合成的引物12000r/min離心5min，室溫靜置１分鐘，然后再慢慢打開管蓋，根據(jù)引物合成單（或儲存引物的離心管）說明加入一定量的滅菌水（引物說明是加入Buffer，此處加入無菌水即可）以達(dá)到10uM的濃度，在漩渦振蕩器上充分振蕩5-10min，即配成10um的貯存液，-20℃保存?zhèn)溆?br /> PCRbuffer 一般PCR Buffer為10×的，使用時終濃度應(yīng)為1×。如25ul體系中，應(yīng)加入10×PCR Buffer為2.5ul。另外使用時應(yīng)注意是否添加了Mg2+，若沒有，則需要再單獨添加，有則無需。 Mg2+ 推薦用量為１—４ｍM。濃度過低，影響PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量，而濃度過高，則出現(xiàn)非特性擴(kuò)增。在PCR反應(yīng)中Mg2+濃度，需進(jìn)行優(yōu)化。 三磷酸脫氧核苷酸（dNTPs） 避免反復(fù)凍融，應(yīng)分裝小份。dNTP的濃度取決于PCR反應(yīng)體系中的特定靶序列的長度，常用濃度為0.2 mM。據(jù)此我們可以確定反應(yīng)體系中的dNTP的最低適宜濃度。當(dāng)dNTP的濃度大于50mmol/L時會抑制Taq酶的活性。需要注意的是dNTP與Mg2+之間的濃度關(guān)系。因為dNTP中的磷酸基團(tuán)可與Mg2+結(jié)合，使反應(yīng)體系中游離Mg2+濃度下降從而影響Taq 酶的活性。 Taq酶 PCR使用的Taq酶在反應(yīng)時由于喪失3’——>5’外切核酸酶活性，因而不具有校正活性。在典型的一次PCR反應(yīng)中，taq酶造成的錯誤的核苷酸錯誤的摻入率大概為每20000個核苷酸中就有一個，雖然表面上看起來不會有多大的影響，但是在分子克隆中如果有一個錯誤核苷酸摻入，很有可能造成移碼突變，影響是嚴(yán)重的。為彌補taq酶這一缺點常將克隆后的序列進(jìn)行測序，來確認(rèn)所擴(kuò)增序列的準(zhǔn)確性。同時也可采用保真度更高的Pfu DNAPolymerase，來確保擴(kuò)增的準(zhǔn)確性，Pfu DNAPolymerase有3 ’-5’的外切酶活性，5’-3’外切酶活性，是目前已發(fā)現(xiàn)的所有耐高溫DNA 聚合酶中出錯率最低的。但PCR產(chǎn)物為平端，不能進(jìn)行Ta克�。《鉀Q此問題的辦法是使用TaqPlus DNAPolymerase，該酶是Taq 酶和pfu Polymerase的混合物，因此既能保證準(zhǔn)確性又能保證能夠進(jìn)行Ta克隆。在使用中應(yīng)該注意如下問題： 1．25ul體系中一般用量為0.1ul（用槍頭沾一下即可），用量過多可能會出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。 2.PCR體系構(gòu)建過程中最后加入的一種成分，因此只有在其他試劑加完之后才可從冰箱中取出加入。 3.Taq酶中含有甘油，故不結(jié)冰，若結(jié)冰則應(yīng)丟棄。 4.對于預(yù)變性時間較長的PCR反應(yīng)，應(yīng)在預(yù)變性即將結(jié)束后加入酶，減少長時間高溫對酶活力造成的損傷。 5.保存時間過長的酶可以適當(dāng)增加用量。 三、體系構(gòu)建 1.加樣原則是酶最后加，倒數(shù)第二加的為模板。加樣時應(yīng)從離心管底部將各成分依螺旋式上升的方式加到管壁上。如果做多管PCR，那么按照如下方法計算出公共成分做n管時所需總體積然后混合均勻之后再分裝到各個離心管中去，這樣可以有效地避免誤差及污染。 V總 =V標(biāo)×（n+1） 其中V總需配制的總體積V標(biāo)每管PCR反應(yīng)需要某成分的標(biāo)準(zhǔn)體積，n表示所做PCR的管數(shù)。 2設(shè)立適當(dāng)?shù)年栃詫φ蘸完幮詫φ�，檢測PCR各試劑的可用性及污染性，便于對電泳結(jié)果準(zhǔn)確的分析。 四、預(yù)實驗 準(zhǔn)備一個冰盒，并將做PCR的各試劑（除酶）、模板及無菌水放到冰上融化，設(shè)置PCR儀上反應(yīng)程序。 五、實驗步驟 下列步驟均在冰上操作 1. 取1.5ml離心管，加入各公共成分（除酶）的V總，然后分裝于各PCR管中，最后將酶加入。 2. 瞬時離心10s，將各成分混勻。 3. 放入PCR儀反應(yīng)。 4. 4℃冰箱保存。 5. 電泳檢測。 注：常用于PCR的DNA聚合酶多要求反應(yīng)必須冷啟動，即反應(yīng)必須在瞬間從低溫達(dá)到變性溫度（一般94℃）。但有些酶需要熱啟動，則無需在冰上操作，但酶同樣還是需要現(xiàn)用現(xiàn)取，保持酶的最大活性。 示例 PCR反應(yīng)體系（25μl）及條件如下： 質(zhì)粒DNA 0.5μl 上游特異性PCR引物 0.5μl 下游特異性PCR引物 0.5μl 10×PCRbuffer 2.5μl Mg2+ 1.5μl dNTP 0.5μl Taq PCR聚合酶 0.1μl 滅菌水 18.9μl 預(yù)變性 94℃ 2min 變性 94℃ 30s 退火 59℃ 30s 延伸 72℃ 1min 循環(huán)數(shù) 30 cycles 后延伸 72℃ 10min 整理于網(wǎng)絡(luò)，希望對一些需要的伙伴有用。如有侵權(quán)，可聯(lián)系我們刪除。 |
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