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[交流]
質(zhì)粒重組一直做不出來啊，求大神分析一下原因啊，拜托啦�。ㄎ視M可能詳細描述） 已有11人參與
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目前一直在做質(zhì)粒重組，把目的基因和載體連起來然后進行后續(xù)使用，但是反反復復快2個月了，一直沒有成功啊，很沮喪，請大神幫忙指點迷津啊 1.酶切：我目前想用pcs2載體（4700bp）與想要的幾個基因重組構建，分別是基因A（1700bp），基因B（1300bp），基因C（1000bp）。粘性末端酶切，載體酶切切膠回收，目的基因酶切后過柱純化，過程順利（自認為此步應該不會有問題）。 2.連接：按照說明書計算摩爾體積比混合（總體積10ul，酶和buffer個1ul），這么長時間摸過很多條件：目的基因和載體（100ng）比例做過10比1（做得最多），8比1，3比1，5比1，連接時間大部分選擇4度過夜，甚至4度反應2天3天也有，15度過夜也做過。（NEB和TAKARA兩個公司的都用過，應該不是酶的問題）有時候當沒做出克隆我會將沒用來轉(zhuǎn)化的液體跑膠看看連上了沒，但是可以跑出來N多條帶，除了能找到載體和目的基因的2條，從10000bp到1000bp會出現(xiàn)5，6個條帶（難道是連接成環(huán)狀質(zhì)粒所以跑膠條帶很多？那么說連上了？），我是看不懂了。 3.產(chǎn)物轉(zhuǎn)化圖版：感受態(tài)用的是商品化的dh5a或者top10，步驟一樣（冰30min，42度90s，冰3min），最初我用10ul感受態(tài)+1ul連接產(chǎn)物沒有結果，師兄說多加點，所以我把鏈接產(chǎn)物一直往上加，最多到過9ul，感受態(tài)不變，但是一直沒有結果。轉(zhuǎn)化完加dd水200ul搖菌復蘇45-60min，我之前其實是用soc搖的，但是實驗室soc出了點問題，所以師兄讓我用水搖，他之前是可以做出來的，我做陽性對照的時候也可以做出菌落（但是菌落數(shù)總不多，不超過200個，而且長得很慢，24h最大的菌落不過1mm左右，感覺效率很低，我陽對加1ul轉(zhuǎn)化，里面有200多ng的質(zhì)粒），復蘇后取100ul圖版，37度過夜。結果永遠只有陽性對照有菌落，做過載體自連對照，陰性對照，都沒有，很沮喪。 問題：難道是dna的數(shù)量太少？連接總共就100ng還沒有全做轉(zhuǎn)化，畢竟200ng的陽對轉(zhuǎn)的效率也不高��；難道是我產(chǎn)物和感受態(tài)配比不對？最近看到連接產(chǎn)物不應超過體系10%，多了感受態(tài)會脹破，難道是因為這個；難道是我用水去復蘇導致效率不高，但是我用陽對是可以的呀，不至于做了這么久一個克隆也不長吧？ 現(xiàn)在老板讓我把基因的pcr產(chǎn)物做ta克隆然后在切下來連，說如果酶切位點在dna兩頭酶切得到的粘性末端不好，連接效率低，讓連到質(zhì)粒上切的好，不知道是不是這個原因？？？（但是我跑膠出來很多條帶說明我臉上了？） 求大家指點迷津啊啊啊啊，做了這么久都沒結果，哎  |
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9樓2017-07-11 15:15:01
MAS_rice
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2樓2017-07-10 23:06:20
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建議目的基因和載體比例做6:2或5:3，酶連時間四度過夜，或者快連酶22度兩小時。 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
3樓2017-07-10 23:13:40
傷何處
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4樓2017-07-11 00:16:45
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