其實步驟和雙酶切是一樣的。知識兩個酶的反應(yīng)溫度和Buffer不一樣，需要分步進(jìn)行。

建議樓主這樣做：
在第一次酶切后用膠回收試劑盒或者PCR產(chǎn)物純化試劑盒將你所要的大小一致的片段回收回來，然后對所回收的產(chǎn)物進(jìn)行第二次酶切，酶切后用同樣的方法姜產(chǎn)物回收回來。建議您用NEB公司的酶，TaKaRa公司的酶有些時候不好使，不穩(wěn)定。
     另外，如果有可以共用Buffer的，也可以試一試，我的經(jīng)驗是雙酶切雖然節(jié)省時間，但是經(jīng)常切不開或者酶切的不完全。影響下一步的反應(yīng)。如果時間允許的話，盡量用分布酶切，這樣雖然時間要長一些，但是可以提高效率，防止實驗材料的浪費。
     最后，提醒樓主一點，分步酶切的時候因為每一步都有少許樣品的損失，所以一定要準(zhǔn)備充足的樣品。一般是正常樣品量的1.5倍，

同意樓上的~

第一次酶切完后可以用純化試劑盒回收，或乙醇沉淀，第二次酶切回收要看酶切片段大小了，切下不用的那段片段小的話就可以純化回收，大的話要膠回收，都有相應(yīng)的試劑盒

如果分步酶切的話，最好準(zhǔn)備足量的質(zhì)粒或目的片段。
在酶切中，如果有一個酶的效率很低的，就先用效率低酶大量的切，然后膠回收已切開片段，再用效率高的酶切，這樣的話，可以在很大程度上降低空載或假陽性率

尤其是當(dāng)你切得兩個酶切位點很近（比如都在多克隆位點上），看不到切下來的小片段時，最好先用低效的切