巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞提取蛋白濃度低，該怎么辦
最近在從巨噬細(xì)胞中提取蛋白，提出蛋白后用BCA測(cè)定蛋白濃度，但是只有0.8mg/ml左右，不知道該怎么辦，求各位大神指點(diǎn)一下。
具體操作步驟如下：
先是鋪板后給藥，提蛋白前細(xì)胞已經(jīng)特別密集的分布到六孔板中有些甚至疊起來(lái)。
1.細(xì)胞用培養(yǎng)基吹打下來(lái)，收集細(xì)胞懸液1000rpm離心5分鐘（因?yàn)橐峥偟鞍装さ鞍讻](méi)就沒(méi)用胰酶消化）。
2.用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，每次洗滌后盡可能吸干上清。
3.每孔加入150μl RIPA裂解液（臨用前加入PMSF，終濃度為1mM）混勻，轉(zhuǎn)入96孔板中4℃震蕩30分鐘。
4.14000rpm離心10分鐘。將上清快速吸入預(yù)冷的干凈EP管中（注意不要吸到沉淀）。
5.BCA測(cè)定蛋白濃度。
我這樣提取出來(lái)的濃度最大也就0.8mg/ml,后來(lái)每孔加100ul的 RIPA裂解液甚至兩個(gè)孔加100ul的RIPA裂解液濃度也一直上不來(lái)。不知道是什么原因，都快要愁死了。。。RIPA裂解液我是用的碧云天的 P0013B，強(qiáng)的裂解液，含有20mM Tris (pH7.5)， 150mM NaCl， 1% Triton X-100，以及sodium pyrophosphate， β-
glycerophosphate， EDTA， Na3VO4， leupeptin等多種抑制劑。說(shuō)是有蛋白酶抑制劑，磷酸酯酶抑制劑。
求各位大神指點(diǎn)一下。。。。。
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京公網(wǎng)安備 11010802022153號(hào)
我覺(jué)得主要是細(xì)胞裂解不充分，還有就是你加裂解液太多了30-50ｕl 即可！另外你收集細(xì)胞的時(shí)候離心速度大點(diǎn)10000rpm左右吧。裂解細(xì)胞時(shí)，用裂解液把tube中的細(xì)胞吹散（反復(fù)三十次），放至室溫三十分鐘，然后放到四度400-500rpm震蕩，接下來(lái)的基本沒(méi)什么問(wèn)題！
1。收集細(xì)胞的時(shí)候離心速度大點(diǎn)10000rpm左右吧——轉(zhuǎn)速這么高，細(xì)胞不會(huì)破裂么？
2.裂解液太多了30-50ｕl ——我們是放到離心管里離心，吸干PBS后用RIPA重懸，再轉(zhuǎn)移到96孔板震蕩，這樣的話液體量少，轉(zhuǎn)來(lái)轉(zhuǎn)去不就沒(méi)了么？每次上樣20-30ul，這樣提一次也就夠一兩次WB，太費(fèi)體力，時(shí)間了吧。
3.請(qǐng)問(wèn)一下你們是如何提高蛋白濃度的
，
1. 不會(huì)破壞細(xì)胞，我用13000rpm
2. 不用轉(zhuǎn)到96空板振，就放在tube中振，你的細(xì)胞就是裂解不好才濃度低的
我的問(wèn)題已經(jīng)解決，但跟你說(shuō)的有些差別，還是很感謝你