實(shí)驗(yàn)原理
        MTT檢測(cè)原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。該方法已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測(cè)、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞毒性試驗(yàn)以及腫瘤放射敏感性測(cè)定等。它的特點(diǎn)是靈敏度高、經(jīng)濟(jì)。缺點(diǎn)：由于MTT經(jīng)還原所產(chǎn)生的甲瓚產(chǎn)物不溶于水，需被溶解后才能檢測(cè)。這不僅使工作量增加，也會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響，而且溶解甲的有機(jī)溶劑對(duì)實(shí)驗(yàn)者也有損害。

實(shí)驗(yàn)試劑
        1. MTT 溶液的配制方法：通常，此法中的MTT 濃度為5mg/ml。因此，可以稱取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸緩沖液（PBS）或無酚紅的培養(yǎng)基中，用0.22μm濾膜過濾以除去溶液里的細(xì)菌，放4℃避光保存即可。在配制和保存的過程中，容器最好用鋁箔紙包住。
        2. 配制MTT時(shí)用PBS（pH=7.4）溶解。
        PBS配方：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4 1.44g，KH2PO4 0.24g調(diào)pH7.4，定容1L。

實(shí)驗(yàn)步驟

普通MTT法實(shí)驗(yàn)步驟：
        1. 接種細(xì)胞：用含10％胎小牛血清得培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔1000-10000個(gè)細(xì)胞（細(xì)胞濃度的問題見后面的注意事項(xiàng)）接種到96孔板，每孔體積200ul.
        2. 培養(yǎng)細(xì)胞：同一般培養(yǎng)條件，培養(yǎng)3-5天（可根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康暮鸵�求決定培養(yǎng)時(shí)間）。
        3. 呈色：培養(yǎng)3-5天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS配制，pH=7.4)10ul.繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，對(duì)于懸浮細(xì)胞需要離心后再吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加100ul DMSO，振蕩10min，使結(jié)晶物充分融解。
        4. 比色：選擇490nm波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值，記錄結(jié)果，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

藥物MTT法實(shí)驗(yàn)步驟：
貼壁細(xì)胞：
        1. 收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，每孔加入100ul，鋪板使待測(cè)細(xì)胞調(diào)密度1000- 10000 /孔，（細(xì)胞濃度的問題見后面的注意事項(xiàng)）。
        2. 5%CO2，37℃孵育，至細(xì)胞單層鋪滿孔底（96孔平底板），加入濃度梯度的藥物，原則上，細(xì)胞貼壁后即可加藥，或兩小時(shí)，或半天時(shí)間，但我們常在前一天下午鋪板，次日上午）加藥.一般5-7個(gè)梯度，每孔100ul，設(shè)3-5個(gè)復(fù)孔.建議設(shè)5個(gè)，否則難以反應(yīng)真實(shí)情況
        3. 5%CO2，37℃孵育16-48小時(shí)，倒置顯微鏡下觀察。
        4. 每孔加入10ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4h。若藥物與MTT能夠反應(yīng)，可先離心后棄去培養(yǎng)液，小心用PBS沖2-3遍后，再加入含MTT的培養(yǎng)液。
        5. 終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。
        6. 每孔加入100ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD490nm處測(cè)量各孔的吸光值。
        7. 同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對(duì)照孔（細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜）。
懸浮細(xì)胞：
        1. 收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞懸液濃度1×106/ml（細(xì)胞濃度的問題見后面的注意事項(xiàng)），按次序?qū)ⅱ傺a(bǔ)足的1640（無血清）培養(yǎng)基40ul ；②加Actinomycin D（有毒性）10ul用培養(yǎng)液稀釋 (儲(chǔ)存液100mg/ml，需預(yù)試尋找最佳稀釋度，1:10-1:20)；③需檢測(cè)物10ul；④細(xì)胞懸液50ul（即5×104cell/孔），共100ul加入到96孔板（邊緣孔用無菌水填充）。每板設(shè)對(duì)照（加100ml 1640）
        2. 置37℃，5%CO2孵育16-48小時(shí)，倒置顯微鏡下觀察。
        3. 每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。（懸浮細(xì)胞推薦使用WST-1，培養(yǎng)4 h后可跳過步驟4），直接酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD570nm（630nm校準(zhǔn)）測(cè)量各孔的吸光值）
        4. 離心（1000轉(zhuǎn)x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD570nm（630nm校準(zhǔn)）測(cè)量各孔的吸光值。
        5. 同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對(duì)照孔（細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜），每組設(shè)定3復(fù)孔。

注意事項(xiàng)
        1. 選擇適當(dāng)?shù)眉?xì)胞接種濃度和培養(yǎng)時(shí)間。
        2. 設(shè)置調(diào)零孔（只加培養(yǎng)基100ul、MTT10ul、二甲基亞砜100ul）。
        3. 設(shè)置空白孔（細(xì)胞、藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液共100ul、10ulMTT 、100ul二甲基亞砜）。
        4. MTT實(shí)驗(yàn)吸光度最后要在0-0.7之間，超出這個(gè)范圍就不是直線關(guān)系。
        5. 96孔板邊緣32孔用無菌PBS填充，因?yàn)檫吘壍?2孔中水分蒸發(fā)很快，藥物易被濃縮，對(duì)實(shí)驗(yàn)影響大。同時(shí)加入PBS液填充后，可以一定程度上保持中間孔的水分。
        6. 防止藥物與MTT反應(yīng)。如果96孔板中加入了具有氧化還原性的藥物，比如谷胱甘肽、Vit E、VitC，那建議用PBS將細(xì)胞洗洗，否則這些藥物會(huì)將MTT還原成棕褐色沉淀，這種效果可能是不需要的。
        7. 吸收值分析。在理想的MTT實(shí)驗(yàn)中，如果是細(xì)胞抑制實(shí)驗(yàn)，不加藥物處理的空白組的吸收值應(yīng)該在0.8-1.2左右，太小檢測(cè)誤差占的比例較多，太大吸收值可能已經(jīng)超出線性范圍。這個(gè)原理在朗伯-比爾定律中有解釋。
        8. 培養(yǎng)過程中換液。100ul的培養(yǎng)液對(duì)于10的4～5次方的增殖期細(xì)胞來說，很難維持50h以上，如果營(yíng)養(yǎng)不夠的話，細(xì)胞會(huì)由增殖期漸漸趨向G0期而趨于靜止，影響結(jié)果。如果培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)，在48h應(yīng)該換液一次。
        9. 避免血清干擾。高的血清物質(zhì)會(huì)影響試驗(yàn)孔的光吸收值。由于試驗(yàn)本底增加，會(huì)試驗(yàn)敏感性。因此，一般選小于10％胎牛血清的培養(yǎng)液進(jìn)行。在呈色后，盡量吸凈培養(yǎng)孔內(nèi)殘余培養(yǎng)液。
        10. 判斷污染。如加入MTT后都有個(gè)別孔立即變?yōu)樗{(lán)黑色，則污染的可能性極大。在加MTT前可以先在鏡下觀察，看看是否有孔染菌，染菌的孔常常是臨近的。
        11. 加DMSO前要把液體小心吸掉。但培養(yǎng)液里的紫色結(jié)晶可能會(huì)吸去，可在這之前先用平板離心機(jī)離心96孔板，2000r，5分鐘，然后吸掉上清(如果是懸浮細(xì)胞，則推薦此法，懸浮細(xì)胞要離心2500rpm×10min.且其做MTT最好用圓底型96孔板，清除上清時(shí)注意不要把下面的結(jié)晶顆粒吸掉。對(duì)于貼壁細(xì)胞，可以試著將96孔板傾斜30度角，然后用槍尖慢慢吸。
        12.MTT法只能用來檢測(cè)細(xì)胞相對(duì)數(shù)和相對(duì)活力，但不能測(cè)定細(xì)胞絕對(duì)數(shù)。在用酶標(biāo)儀檢測(cè)結(jié)果的時(shí)候，為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的線性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范圍內(nèi)。MTT一般最好現(xiàn)用現(xiàn)配，過濾后4oC避光保存兩周內(nèi)有效，或配制成5mg/ml保存在-20度長(zhǎng)期保存，避免反復(fù)凍融，最好小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解。一般都把MTT粉分裝在EP管里，用的時(shí)候現(xiàn)配，直接往培養(yǎng)板中加，沒必要一下子配那么多，尤其當(dāng)MTT變?yōu)榛揖G色時(shí)就絕對(duì)不能再用了。MTT有致癌性，用的時(shí)候小心，有條件最好帶那種透明的簿膜手套.配成的MTT需要無菌，MTT對(duì)菌很敏感；往96孔板加時(shí)不避光也沒有關(guān)系，畢竟時(shí)間較短，或者不放心的時(shí)候可以把操作臺(tái)上的照明燈關(guān)掉。 返回小木蟲查看更多