1 首先確認(rèn)一下TEV的酶切位點(diǎn)有沒(méi)有突變或其它問(wèn)題
2 確認(rèn)一下是真的復(fù)性成功了還是只是形成了可溶性聚集體或其它非正確構(gòu)象的狀態(tài)？有測(cè)活性嗎？有活性的話，有跑HPLC看一下是否是一個(gè)均一峰嗎？
3 確認(rèn)一下酶切溶液是否合適
4 以上都沒(méi)問(wèn)題的話，可能是你的蛋白折疊后影響了酶切序列的暴露，由于存在空間位阻，TEV不能識(shí)別�？梢圆椴檫@個(gè)蛋白的結(jié)構(gòu)有沒(méi)有人解出來(lái)，有的話可以看看N端的空間結(jié)構(gòu)。

由于實(shí)驗(yàn)條件有限沒(méi)有測(cè)，填料和TEV酶都是買的NEB的！按照說(shuō)明書(shū)來(lái)的。

引用回帖:

3樓: Originally posted by ~沙~ at 2020-08-21 13:30:38
由于實(shí)驗(yàn)條件有限沒(méi)有測(cè)，填料和TEV酶都是買的NEB的！按照說(shuō)明書(shū)來(lái)的。

商業(yè)化的酶，按說(shuō)明書(shū)的條件切的，默認(rèn)酶切體系沒(méi)問(wèn)題，沒(méi)切出來(lái)，那么大概率是你的蛋白的問(wèn)題了。TEV識(shí)別的位點(diǎn)是ENLYFQG，切在Q-G之間。幾種可能性：
1. 載體上TEV識(shí)別的酶切序列發(fā)生突變，導(dǎo)致不能識(shí)別。建議：測(cè)序驗(yàn)證一下；
2. TEV酶切位點(diǎn)序列正確，但是存在空間位阻，分兩種情況：
   2.1 蛋白結(jié)構(gòu)正確：酶切位點(diǎn)前面的MBP標(biāo)簽和后面連的目的蛋白的空間結(jié)構(gòu)影響了酶切位點(diǎn)的暴露，使TEV無(wú)法接觸識(shí)別。建議：可以嘗試在酶切位點(diǎn)與標(biāo)簽之間添加Linker，拉長(zhǎng)位點(diǎn)與MBP的距離。
   2.2 最大的可能性，蛋白沒(méi)有復(fù)性成功，碰到好多人都誤以為蛋白從沉淀轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇苄匀芤籂顟B(tài)就是復(fù)性成功了，實(shí)際上復(fù)性遠(yuǎn)沒(méi)那么簡(jiǎn)單�？扇苄誀顟B(tài)可以是可溶性聚集體，也可以是多種不同構(gòu)象的混合物，實(shí)現(xiàn)這種轉(zhuǎn)變太簡(jiǎn)單了，但要將其結(jié)構(gòu)歸一成完全正確的構(gòu)象那才是最困難的，所以懷疑你的蛋白沒(méi)有折疊成功，而結(jié)構(gòu)不對(duì)又影響了酶切位點(diǎn)的暴露，導(dǎo)致切不開(kāi)。

基因是讓別人合成的，反饋報(bào)告沒(méi)問(wèn)題，中間也有了解linker.我是先在6M鹽酸胍中透析變性，再透析復(fù)性，全程沒(méi)有沉淀。我怎么知道我的蛋白復(fù)性成功沒(méi)？像我現(xiàn)在這樣，還有什么可以去嘗試的？謝謝

引用回帖:

5樓: Originally posted by ~沙~ at 2020-08-21 17:46:48
基因是讓別人合成的，反饋報(bào)告沒(méi)問(wèn)題，中間也有了解linker.我是先在6M鹽酸胍中透析變性，再透析復(fù)性，全程沒(méi)有沉淀。我怎么知道我的蛋白復(fù)性成功沒(méi)？像我現(xiàn)在這樣，還有什么可以去嘗試的？謝謝
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有條件的話，拿透析后酶切前的樣品和鹽酸胍+還原劑徹底變性的樣品分別跑一下反相，比較一下出峰位置以及峰形，通常蛋白折疊后疏水側(cè)鏈折入分子內(nèi)部，親水性增強(qiáng)，在反相上出峰位置會(huì)提前，如果透析后樣品能跑出較明顯的均一峰，那么有可能這個(gè)峰是復(fù)性成功的部分（也可能不是），但如果跑出來(lái)的峰沒(méi)有主峰，很雜亂，那么應(yīng)該是復(fù)性失敗了，形成了眾多可溶性的雜亂構(gòu)象及其聚集體。

如果有合適Maker的話，也可以跑一下Native-PAGE，看看是不是聚集體。如果目的蛋白含較多Cys，也可以嘗試跑還原-非還原電泳，看看是不是二硫鍵錯(cuò)配產(chǎn)生的聚集體。有分子篩的話也可以跑一下看看有沒(méi)有聚集體。

如果沒(méi)復(fù)性成功，那只能根據(jù)蛋白性質(zhì)摸方法，復(fù)性跟其它東西不一樣，沒(méi)有什么好的套路，只能根據(jù)蛋白的性質(zhì)去相應(yīng)設(shè)計(jì)復(fù)性條件，這個(gè)是沒(méi)辦法給你提供建議的。只能建議你分析一下一級(jí)序列，然后設(shè)計(jì)一些實(shí)驗(yàn)去了解你蛋白的性質(zhì)，分析它為什么會(huì)形成包涵體，然后反其道而行之，使用合適的方法、試劑對(duì)癥下藥進(jìn)行優(yōu)化
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引用回帖:

4樓: Originally posted by zsygxh at 2020-08-21 17:02:55
商業(yè)化的酶，按說(shuō)明書(shū)的條件切的，默認(rèn)酶切體系沒(méi)問(wèn)題，沒(méi)切出來(lái)，那么大概率是你的蛋白的問(wèn)題了。TEV識(shí)別的位點(diǎn)是ENLYFQG，切在Q-G之間。幾種可能性：
1. 載體上TEV識(shí)別的酶切序列發(fā)生突變，導(dǎo)致不能識(shí)別。建議： ...

您好！請(qǐng)問(wèn)在標(biāo)簽和酶切位點(diǎn)之間添加linker的話是添加什么linker呢？