請(qǐng)教！雙酶切一直不成功
想做原核表達(dá)。TA克隆測(cè)序成功的質(zhì)粒以及PET-28a載體雙酶切后連接。TA克隆時(shí)連接的載體是全式金的simple cloning vetor。
質(zhì)粒1與pet28a是用HindIII和BamHI（takara的快切酶）。質(zhì)粒2與pet28a是用NcoI和BamHI（takara的快切酶）。采用的先30度3小時(shí)切BamHI，然后37度3小時(shí)切HindIII（質(zhì)粒2相同條件）。用的50的體系，兩種酶各1，green buffer5，質(zhì)粒3。
酶切后電泳圖如下，質(zhì)粒1，2長(zhǎng)度約2000bp,泳道1為5000marker,后幾個(gè)孔分別為質(zhì)粒1，載體，質(zhì)粒2，載體。
想問(wèn)的問(wèn)題:
1.酶切后直接電泳？看到有朋友先高溫失活再電泳。
2.酶切不成功，但是條帶怎么這樣？求解
3.如何正確酶切？
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京公網(wǎng)安備 11010802022153號(hào)
(1) 無(wú)論是高溫失活后再電泳還是直接電泳應(yīng)該都不礙事
(2) pet28a是不是切出來(lái)了這個(gè)圖看不出來(lái)，因?yàn)榍谐鰜?lái)的短片段太小了，所以理論上只能看到一個(gè)相當(dāng)于pet28a載體長(zhǎng)度的線性片段
(3) 檢查一下雙酶切buffer是不是合適，同時(shí)用兩個(gè)酶切的話buffer按這個(gè)表格走：https://www.takarabio.com/us/pro ... e_digestion_buffers，
酶減半，過(guò)夜酶切。心急吃不了熱豆腐。
或者T載體上的酶切位點(diǎn)發(fā)生突變。
電泳質(zhì)量不好。先把marker跑整齊啊。電泳夜不對(duì)？
切沒(méi)切開(kāi)，你要同時(shí)跑沒(méi)有酶切的質(zhì)粒。切前切后發(fā)現(xiàn)有區(qū)別的。