構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體，基因CDS大片段缺失
大家好，我最近想構(gòu)建一個(gè)基因的過(guò)表達(dá)載體。從CDS中PCR該基因（3100bp)，條帶單一，大小正確，回收的基因片段測(cè)通，序列正確。但是我用同源重組的方式，將基因片段連接到慢病毒載體上，轉(zhuǎn)化后酶切驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)插入片段只有1000bp左右，測(cè)序也發(fā)現(xiàn)中間有2000多bp 的缺失。后面想到可能發(fā)生了細(xì)菌重組，從原來(lái)的DH5a感受態(tài)改為用Stbl3和Stable感受態(tài)，但是酶切結(jié)果顯示插入片段還是只有不到1000bp。后來(lái)直接把膠回的基因片段連到T載體上，用Stbl3和Stable感受態(tài)轉(zhuǎn)化，依然發(fā)現(xiàn)插入片段大范圍缺失。
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京公網(wǎng)安備 11010802022153號(hào)
你查查你的基因里有沒(méi)有這個(gè)酶切位點(diǎn)
我也遇到過(guò)類(lèi)似的事情，當(dāng)時(shí)我們做的是APOE基因，PCR結(jié)果很好，插入片段均有缺失（缺失的位置有幾種，且可重復(fù)）。這個(gè)我們最后只能通過(guò)密碼子優(yōu)化用大量同義突變進(jìn)行替換，最終完成克隆。so，也推薦你這么試試。你玩的是哪個(gè)苦逼的基因埃?/p>
酶切回收過(guò)程中，電泳時(shí)你的插入片段大小對(duì)應(yīng)的上嗎？是1000bp還是3000bp？