轉染是指將外源基因導入細胞內的一種生物學技術。轉染可分為物理介導、化學介導和生物介導三類途徑。物理介導方法有電穿孔法、顯微注射和基因槍法,化學介導方法很多,如磷酸鈣共沉淀法、脂質體轉染方法、和多種陽離子物質介導技術,生物介導方法,有較為原始的原生質體轉染,和現在比較多見的各種病毒介導的轉染技術。

病毒載體是以病毒為基礎進行改造而獲得的載體,已經成為目前最常用的轉染方式之一。通過對病毒基因組進行改造,能夠使其攜帶外源的目的基因。將其包裝成病毒顆粒后,通過侵染宿主細胞,能夠將外源目的基因一并帶入宿主細胞中。與傳統(tǒng)方法相比,病毒轉染在真核細胞中的效率更高,尤其是在傳統(tǒng)方法難以發(fā)揮作用的哺乳動物實驗中,病毒轉染法發(fā)揮著重要的作用。

病毒轉染系統(tǒng)的分類:目前常用的病毒載體包括慢病毒載體、腺病毒載體和逆轉錄病毒載體。

慢病毒載體:慢病毒載體是以HIV-1(人類免疫缺陷I型病毒)為基礎發(fā)展起來的基因治療載體。和普通逆轉錄病毒載體不同的是,它對分裂細胞和非分裂細胞均都具有感染能力。慢病毒載體可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上,從而達到持久性表達。


腺病毒載體:腺病毒載體是以腺病毒發(fā)展出的一類載體。和慢病毒載體不同的是,腺病毒載體不會將外源目的基因或自身的病毒基因整合到宿主細胞的基因組中,而是游離在宿主基因組外獨立的表達�；�于這一特性,腺病毒載體能夠實現外源基因的瞬時表達,同樣也由于不對宿主基因組進行整合而避免了潛在的基因突變,具有更好的可控性。


逆轉錄病毒表達載體:逆轉錄病毒是一種單鏈RNA病毒,它是能夠在逆轉錄酶的作用下將 RNA 轉變成 cDNA,再在DNA復制、轉錄、翻譯等蛋白酶作用下擴增的一類病毒。根據逆轉錄病毒的一些特性設計出的一種復制缺陷性病毒,使其成為能夠攜帶某種特異目的基因的表達載體,即逆轉錄病毒載體。

病毒轉染細胞的方法(以慢病毒為例):

慢病毒轉染貼壁細胞實驗方法

1、 慢病毒轉染前18-24小時,將貼壁細胞以1×105/孔鋪到24孔板中。使細胞在慢病毒轉染時的數量為2×105/孔左右。

2、第二天,用含有6 μg/ml polybrene的2ml新鮮培養(yǎng)基替換原培養(yǎng)基,加入適量病毒懸液。37℃孵育。

3、(對polybrene毒性敏感的細胞選作此步驟)4小時后加入2ml新鮮培養(yǎng)基以稀釋polybrene。

4、繼續(xù)培養(yǎng)24小時,用新鮮培養(yǎng)基替換含有病毒的培養(yǎng)基。

5、繼續(xù)培養(yǎng)。如果慢病毒含有熒光蛋白,一般轉染48小時后可見明顯熒光表達,72小時后更加明顯。如需FACS檢測轉染效率,可在轉染后72-96小時進行。如果慢病毒含有抗性基因并且需要加藥篩選,可以在轉染3-4天后開始加藥。

慢病毒轉染懸浮細胞實驗方法

1、在2×105/ml懸浮細胞中加入polybrene至6 μg/ml和適量病毒,充分混勻。37℃孵育。或者150g室溫離心4小時(選作,部分難轉染的細胞系采用此步驟可以提高轉染效率)。

2、(對polybrene毒性敏感的細胞選作此步驟)4小時后(或離心結束后)加入等體積新鮮培養(yǎng)基以稀釋polybrene。

3、繼續(xù)培養(yǎng)3-4天。中間視細胞生長情況可傳代或換液。

一定要注意的幾點:

感染時的培養(yǎng)基盡量少些;

2. 每1ml的培養(yǎng)基中加入5-10ul的Polybrene(儲存液濃度為2mg/ml ),可以提高效率約3-5倍。不過病毒感染效率的問題都是相對的,達到自己的研究目的即可。 返回小木蟲查看更多