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dhd997

榮譽(yù)版主 (文壇精英)

自由人,我型我秀!

優(yōu)秀版主

★ ★
西瓜(金幣+2): 榮版,給力啊! 2012-01-19 18:16:12
不知道LZ是用什么酶擴(kuò)的,不需要這么長(zhǎng)時(shí)間的變性和延伸也可以的
   如果我來擴(kuò)的話條件是:初始變性  96     6min
                            變性      95        20s
                          退火      58/60     20s
                             延伸      72        2min                     
                                            20---25cycle
                      最終延伸    72       5min

話說要是實(shí)在不好擴(kuò),可以分段重組到載體里
人生不過幾十年,成敗榮辱都在天,是非恩怨莫在意,健康快樂最值錢,自古人間苦無邊,看得高遠(yuǎn)境如仙,愿你不為凡事惱,輕松快樂每一天。
11樓2012-01-19 11:32:41
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mxlo.o

金蟲 (正式寫手)

引用回帖:
10樓: Originally posted by clfhnb at 2012-01-17 15:35:56:
第一次的PCR產(chǎn)物純化最好用切膠的方式純化。。。
重疊延伸的時(shí)候注意兩個(gè)PCR產(chǎn)物的比例  ,一般是1:1..
用一步法的重疊延伸比較好。。。

PCR產(chǎn)物的比例是1:1,如果兩個(gè)片段長(zhǎng)度不同,如何保證1:1, 怎么測(cè)定DNA的濃度,我看一般的方法均是測(cè)定DNA的質(zhì)量濃度。而試驗(yàn)中所需的應(yīng)該是摩爾濃度吧,這個(gè)如何測(cè)定
12樓2012-02-24 10:04:17
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zhaoyonggang

銀蟲 (小有名氣)

除了樓上說的那些可能外,也可能因?yàn)閮蓚(gè)片段本身的關(guān)系擴(kuò)不出。我最近幾個(gè)月也在做一個(gè)overlap PCR,改了很多條件,設(shè)計(jì)了多對(duì)不同的引物,就是沒有作出來。以前做類似的東西都是一次成功的?隙ㄊ悄康钠伪旧碛惺裁磫栴}了,雖然我目前還不知道具體是什么
13樓2012-02-24 13:00:27
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mxlo.o

金蟲 (正式寫手)

引用回帖:
10樓: Originally posted by clfhnb at 2012-01-17 15:35:56
第一次的PCR產(chǎn)物純化最好用切膠的方式純化。。。
重疊延伸的時(shí)候注意兩個(gè)PCR產(chǎn)物的比例  ,一般是1:1..
用一步法的重疊延伸比較好。。。

在做融合PCR的時(shí)候,一般的比例是1:1,但是我對(duì)1:1還有些疑問,不知能否給予解答。1:1指的是DNA片段的總濃度呢,還是片段的分子摩爾數(shù)。比如說,一個(gè)3kb的片段和1.5kb的片段,在濃度相同的情況下,其分子摩爾數(shù)應(yīng)該是不一樣的吧。那么應(yīng)采用哪一個(gè)呢
14樓2012-05-28 09:18:22
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wk990240

新蟲 (初入文壇)

如果條件充許,可以分鐘克隆兩個(gè)片段,比如A和B,并且在A的3端和B的5端加上共有的酶切位點(diǎn),直接兩個(gè)片段回收后,同時(shí)連進(jìn)表達(dá)載體。我經(jīng)常這樣操作,沒有大問題的。祝樓主成功。
15樓2012-05-28 14:36:34
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rainbow8

新蟲 (小有名氣)

等摩爾加兩個(gè)片段試試
學(xué)海無涯,回頭是岸
16樓2012-06-06 16:02:23
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mxlo.o

金蟲 (正式寫手)

引用回帖:
4樓: Originally posted by lmxu0917 at 2012-01-09 15:11:00
1、分別擴(kuò)增兩個(gè)片段,純化后備用
2、以純化后的兩個(gè)片段為模板,以前面片段的5‘端引物和后面片段的3’端引物來進(jìn)行重疊PCR。正常情況下就可以擴(kuò)增出條帶專一的目的條帶了。如果目的條帶很弱可以進(jìn)行步驟3.
3、P ...

我的融合PCR兩個(gè)月前偶然出來一次,自從產(chǎn)物用完之后再?zèng)]有出來過。逐漸摸索條件認(rèn)為是模板的原因,F(xiàn)在通過轉(zhuǎn)化挑單克隆獲得了非常單一的PCR模板。但是還是擴(kuò)增不出來。我的兩個(gè)片段均為1.5kb左右,我配的12.5ul的體系,模板各加100ug,使用兩步PCR,PCR后跑膠,總是在1.5kb出現(xiàn)比較亮的帶,然后自點(diǎn)樣孔到1.5kb處很彌散。不知你遇到過這樣的情況沒,怎么解決
17樓2012-08-13 21:42:09
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sd3824289

木蟲 (正式寫手)

樓主,貌似第二步我也建議你做個(gè)梯度試試,做第二輪PCR的時(shí)候,由于片段大小發(fā)生了變化,GC含量也不一樣了,所以退火溫度也就跟著發(fā)生變化!所以用一下溫度梯度很有用的!希望對(duì)樓主有幫助!
堅(jiān)持,就像流星,即使知道最后的結(jié)果,也要勇敢的走到最后!
18樓2012-08-27 16:28:54
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mikle蘇

銀蟲 (初入文壇)

引用回帖:
10樓: Originally posted by clfhnb at 2012-01-17 15:35:56
第一次的PCR產(chǎn)物純化最好用切膠的方式純化。。。
重疊延伸的時(shí)候注意兩個(gè)PCR產(chǎn)物的比例  ,一般是1:1..
用一步法的重疊延伸比較好。。。

一般如何計(jì)算1:1呢?是根據(jù)比如marker是10ng,然后片段一樣亮的是10ng,更亮的往上增,然后以A1*V1=B2*V2計(jì)算嗎
努力讓自己做的更好
19樓2012-12-13 11:27:38
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于學(xué)丹

新蟲 (初入文壇)

引用回帖:
10樓: Originally posted by clfhnb at 2012-01-17 15:35:56
第一次的PCR產(chǎn)物純化最好用切膠的方式純化。。。
重疊延伸的時(shí)候注意兩個(gè)PCR產(chǎn)物的比例  ,一般是1:1..
用一步法的重疊延伸比較好。。。

你好,我最近也在做重疊PCR,第二步也是出不來,想請(qǐng)問一下兩個(gè)PCR產(chǎn)物的比例都可以是多少啊,我的片段大小分別是500bp,700bp.
20樓2013-04-09 08:22:22
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