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方法
菌株和質(zhì)粒
黑曲霉AB4.1 (van Hartingsveldt et al.,1987)是來(lái)源于黑曲霉N402的pyrG突變株。黑曲霉D15是菌株AB1.13的蛋白酶缺陷菌株(Mattern et al., 1992)，D15能有效降低培養(yǎng)基的酸化(P. Punt, unpublished observation)。ile19突變株由David Gems（(John Innes Centre,Norwich, UK)）友情提供。編碼GFP突變體S65T (Chiu et al., 1996; Haas et al., 1996)的sgfp基因被用在所有的構(gòu)建中。質(zhì)粒pMCB30(Fernandez-Abalos et al., 1998)和pBluescript-sGFP-TyG-nos-hs(Sheen
et al., 1995)均含有sgfp基因。質(zhì)粒pIGF含有黑曲霉glaA啟動(dòng)子和截短的glaA基因（相當(dāng)于499個(gè)氨基酸，G499）和glaA終止區(qū)域(Archer et al., 1994)。質(zhì)粒pAN56-2含有g(shù)laA啟動(dòng)子和截短的glaA基因（相當(dāng)于514個(gè)氨基酸，G514）和黑曲霉trpC終止區(qū)域(EMBLZ-32690)。含有黑曲霉pyrG基因(van Hartingsveldt et al., 1987)的質(zhì)粒pAB4.1和含有細(xì)菌潮霉素抗性(Punt et al., 1987; Punt & van den Hondel, 1992)的質(zhì)粒pAN7.1被用作篩選轉(zhuǎn)化菌株。
生長(zhǎng)和培養(yǎng)條件
含sGFP、GLA514融合蛋白質(zhì)的黑曲霉在BenneH}Lasure培養(yǎng)基上培養(yǎng)，而含GLA499融合蛋白的菌株在Vogel的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)(Vogel, 1956)（經(jīng)修改用10g蔗糖取代麥芽糖糊精或葡萄糖），如果需要用1.5%瓊脂固化。為了鏡檢，含有融合蛋白質(zhì)的菌株的孢子粘合在蓋玻片上，在Petri碟中并在一層薄的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)(Harris et al., 1994)。一種經(jīng)過(guò)修改的soya milk 培養(yǎng)基也被應(yīng)用(MacKenzie et al., 1994)。pyrG突變株的培養(yǎng)基中含有10mM尿苷。無(wú)性孢子的孵育在PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行，培養(yǎng)5-6天后用0.1%吐溫20收獲并用水沖洗2次。所有的培養(yǎng)物在30度培養(yǎng)，如有需要可250轉(zhuǎn)/分?jǐn)嚢枧囵B(yǎng)。
構(gòu)建基因融合和轉(zhuǎn)化子
質(zhì)粒抽提、酶切、DNA連接和大腸桿菌轉(zhuǎn)化參見(jiàn)Sambrook描述（Sambrook et al. (1989)）。圖一顯示不同的構(gòu)建。為了構(gòu)建GLA499: : sGFP編碼區(qū)，以pMCB30為模板PCR擴(kuò)增全長(zhǎng)的742bp sgfp基因。引物為(1) 5«-CGATATCTAGAATGGTGGCAAGGGCGAGGA, (2) 5«-TGACTTCTAGATTACTTGTACAGCTCGTCCA。sgfp片段經(jīng)酶切并連入pIGF上位于glaA基因和glaA終止區(qū)域中的XbaI克隆位點(diǎn)。GLA514: : sGFP編碼基因是通過(guò)從pBluescript-sGFP-TyG-nos-hs(Sheen et al., 1995)克隆sgfp并在兩端加上NcoI（平端）和BamHI位點(diǎn)，而形成載體pAN56-2sGFP。為了構(gòu)建GLA514: : sGFP-HDEL融合基因，以pBluescript-sGFP-TyG-nos-hs(Sheen et al., 1995)為模板。引物為(1)在pBluescript反式引物5«-GGAAACAGCTATGACCATG, and (2) sGFP-HDEL反式引物 5«-CGGGATCCTTACAG CTCGTCGTGCTTGTACAGCTCGTCCATGCC.882bp的sGFP-HDEL片段通過(guò)NcoI和BamHI酶切并克隆到pAN56-2而產(chǎn)生pAN56-2 (sGFP-HDEL)。所有的構(gòu)建都通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證。細(xì)胞質(zhì)蛋白sGFP按照Siedenberg的描述構(gòu)建（Siedenberg et al. (1999)）。
對(duì)于轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，黑曲霉在Vogel培養(yǎng)基（對(duì)于AB4.1菌株額外補(bǔ)充10mM的尿苷）上培養(yǎng)18-20小時(shí)。原生質(zhì)體通過(guò)加20mg的Novozyme 234 (Novo Nordisk) (g wet wt mycelia)-1制的，利用聚乙二醇(Punt&van den Hondel, 1992)把含有sgfp質(zhì)粒pAB4.1和pAN7.1分別轉(zhuǎn)化到AB4.1和N402菌株。轉(zhuǎn)化子經(jīng)過(guò)純化，sgfp的存在通過(guò)Southern雜交(Southern, 1975)和菌落PCR驗(yàn)證(van Zeijl et al., 1998)。 |
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材料與化工考研調(diào)劑
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