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21樓2010-09-07 20:52:59

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whoisthis

鐵蟲(chóng) (小有名氣)

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建議重新設(shè)計(jì)引物

設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照幫你更快找出原因：設(shè)計(jì)擴(kuò)增同一目的基因其他位置或短一點(diǎn)的片段的引物

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22樓2010-09-08 04:28:56

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張曉梅ZXM

金蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)

meimeizhang

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引用回帖:

Originally posted by kangkang997 at 2010-09-06 15:34:45:
延長(zhǎng)時(shí)間是多少��？

40s 45s 50s 90s 120s 都試過(guò)

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每天進(jìn)步一點(diǎn)點(diǎn)，持之以恒！

23樓2010-09-08 08:25:16

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steven689

木蟲(chóng) (著名寫(xiě)手)

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現(xiàn)在有PCR預(yù)混液，可以購(gòu)買，只要你加的模板引物沒(méi)有問(wèn)題，其他的都是現(xiàn)成的

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24樓2010-09-08 08:58:59

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墨香若水

木蟲(chóng) (著名寫(xiě)手)

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設(shè)計(jì)的引物可能有問(wèn)題。樓主最后溶解基因組是否用的是TE，也可能有影響。

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仕不可不弘毅，任重而道遠(yuǎn)

25樓2010-09-08 09:18:02

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yuanfeng

金蟲(chóng) (小有名氣)

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是不是模板加的太多了，稀釋下試下吧。我們以前也遇到過(guò)這種情況，怎么做都pcr不出來(lái)，后來(lái)稀釋了下模板就很快做出來(lái)了。

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26樓2010-09-08 11:36:39

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snzydong

鐵桿木蟲(chóng) (著名寫(xiě)手)

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建議1：是不是考慮重新設(shè)計(jì)引物PCR一下
   2：模板是不是沒(méi)有問(wèn)題，可以批一個(gè)其他的基因，小一點(diǎn)的試一試
   3：用的酶的擴(kuò)增能力怎么樣，我建議用La-Taq酶（TaKAra），即保真擴(kuò)增能力也強(qiáng)
   4：降低退火溫度，DNTP含量增加，調(diào)整鎂離子濃度

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27樓2010-09-08 20:05:42

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michaelwuqingyu

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基因組的PCR有時(shí)候確實(shí)有點(diǎn)難，選個(gè)好的Taq很重要，我們以前用promega的P植物基因組重復(fù)性很差，經(jīng)常擴(kuò)不出來(lái)，換了ROCHE之后就相當(dāng)穩(wěn)定。不過(guò)ROCHE的tgo 高保真P cDNA 不好用。

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28樓2010-09-09 09:43:29

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diaoyuhua

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應(yīng)該是引物的問(wèn)題，試下Touchdown

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29樓2010-09-09 11:13:34

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冬蟲(chóng)夏草1

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引用回帖:

Originally posted by lfkey at 2010-08-27 16:32:23:
溫度太低特異性會(huì)減弱，我覺(jué)得不能低于60度，引物可以少加點(diǎn)，另外摸索退火溫度時(shí)間隔可以再小點(diǎn)；重新設(shè)計(jì)引物到可以考慮一下。檢測(cè)能否擴(kuò)增出條帶的話，我覺(jué)得應(yīng)該沒(méi)有酶或者buffer的事。

buffer也很重要，提供良好的環(huán)境必不可少

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倚樓聽(tīng)風(fēng)雨，淡看江湖路！

30樓2010-09-09 13:44:10

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