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三磷酸腺苷

鐵桿木蟲(chóng) (職業(yè)作家)

★ ★
小木蟲(chóng)(金幣+0.5):給個(gè)紅包,謝謝回帖交流
reasonspare(金幣+1):你說(shuō)得很明白,但是你超聲儀和摟主講的不是一回事,你再講明白也不行,他也應(yīng)用不到他的機(jī)子上 2010-11-05 11:43:05
難道我上面說(shuō)的時(shí)間梯度還不夠明確么
誰(shuí)來(lái)告訴我,我的表達(dá)到底存在神馬問(wèn)題……………………
11樓2010-11-04 21:57:26
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風(fēng)云白荷

銅蟲(chóng) (初入文壇)

reasonspare:如果我沒(méi)有猜錯(cuò)的話,你的超聲波 和前面沖有說(shuō)的不同,他們說(shuō)是水浴那種 “中間不休息哈哈“,你所用的是探頭那種,它是蟲(chóng)友給你線索是可以摸索的,固定中等率, 10s 超聲,30s 間隔,你可以改變循環(huán)次數(shù),10個(gè)循環(huán)不行15, 20, 30, 40, 哈哈。注意隨時(shí)換冰。 2010-11-05 11:47:57
reasonspare:編輯內(nèi)容 2010-11-05 11:57
引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-11-04 21:57:26:
難道我上面說(shuō)的時(shí)間梯度還不夠明確么
誰(shuí)來(lái)告訴我,我的表達(dá)到底存在神馬問(wèn)題……………………

時(shí)間梯度沒(méi)問(wèn)題,難道我的超聲波破碎和你的不一樣嗎?你超聲波破碎的時(shí)候不是要設(shè)置功率,超聲波破碎的時(shí)間,還有間隔時(shí)間嗎?難道你的破碎中間不休息的嗎?機(jī)器一直在工作嗎?那樣熱量不是很大嗎





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發(fā)現(xiàn)自己寫(xiě)得自己也看不清楚 再來(lái)一遍:

如果我沒(méi)有猜錯(cuò)的話,你的超聲波 和前面“三磷酸”說(shuō)的不同,他們說(shuō)的是水浴那種 “中間不休息哈哈“,設(shè)定功率(功率調(diào)節(jié)比較粗糙,沒(méi)有超聲頻率,只有個(gè)超聲頻率)后只能調(diào)整時(shí)間,非常溫和的水浴超聲儀。 你所用的是探頭那種 (可供選擇的參數(shù):超聲頻率,超聲頻率(前邊兩個(gè)參數(shù)不一定都出現(xiàn),不同廠家有異),超聲時(shí)間,間隔時(shí)間,循環(huán)次數(shù)),這種超聲波功率很大,產(chǎn)生大量的熱,所以必須冰浴。

但是三磷酸蟲(chóng)友給你線索還是可以參考,固定中等率 或者頻率通常10-50, (超過(guò)100,要減少超聲時(shí)間,否則 打碎不光你的DNA 蛋白,還有你的探頭), 10s 超聲,30s 間隔,你可以改變循環(huán)次數(shù),10個(gè)循環(huán)不行15, 20, 30, 40, 哈哈。注意隨時(shí)換冰

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[ Last edited by reasonspare on 2010-11-5 at 11:57 ]
12樓2010-11-05 09:21:31
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曾秀鳳

木蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)


小木蟲(chóng)(金幣+0.5):給個(gè)紅包,謝謝回帖交流
我還以為那種實(shí)驗(yàn)就只有交給一些大公司去做呢  原來(lái)自己實(shí)驗(yàn)室也可以做的呀  唉 我們浪費(fèi)了
13樓2010-11-05 11:01:57
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風(fēng)云白荷

銅蟲(chóng) (初入文壇)

引用回帖:
Originally posted by 風(fēng)云白荷 at 2010-11-05 09:21:31:

時(shí)間梯度沒(méi)問(wèn)題,難道我的超聲波破碎和你的不一樣嗎?你超聲波破碎的時(shí)候不是要設(shè)置功率,超聲波破碎的時(shí)間,還有間隔時(shí)間嗎?難道你的破碎中間不休息的嗎?機(jī)器一直在工作嗎?那樣熱量不是很大嗎





— ...

謝謝您的回復(fù),我是按照那個(gè)梯度來(lái)摸索的,但是想摸索到具體片斷長(zhǎng)度還是挺困難的,我已經(jīng)試過(guò)很多條件了,不好弄。
14樓2010-11-05 14:57:45
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magy2006

木蟲(chóng) (著名寫(xiě)手)

好高深的學(xué)問(wèn)……
15樓2010-11-05 16:33:10
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z-w-p

新蟲(chóng) (初入文壇)


小木蟲(chóng)(金幣+0.5):給個(gè)紅包,謝謝回帖
請(qǐng)問(wèn)一下,您做ChIP是自己配的試劑還是有商品化的試劑盒可以直接用?
16樓2012-02-12 15:41:00
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15103323277

新蟲(chóng) (初入文壇)


小木蟲(chóng): 金幣+0.5, 給個(gè)紅包,謝謝回帖
請(qǐng)問(wèn)你的超聲破碎條件是什么啊
17樓2016-07-10 21:16:26
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蘿卜漲價(jià)了

銅蟲(chóng) (初入文壇)


引用回帖:
10樓: Originally posted by 風(fēng)云白荷 at 2010-11-04 20:03:02
你好,謝謝你的回復(fù),你說(shuō)的那個(gè)步長(zhǎng),我知道是什么意思,我不明白的是你這個(gè)步長(zhǎng)指的是超聲波破碎的總時(shí)間還是指破碎的時(shí)候間隔休息的那個(gè)時(shí)間呢?
...

兩個(gè)都不是  這個(gè)步長(zhǎng)是指每次要加的時(shí)間,比如第一次是1,那么第二次時(shí)間就是1+步長(zhǎng),第三次時(shí)間就是在第二次時(shí)間的基礎(chǔ)上再加上步長(zhǎng)。
18樓2018-04-28 09:13:51
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蘿卜漲價(jià)了

銅蟲(chóng) (初入文壇)


另外給樓主的問(wèn)題只涉及到了免疫共沉淀最開(kāi)始的部分,順便分享一下免疫共沉淀的實(shí)驗(yàn)操作步驟
1.用預(yù)冷的磷酸緩沖液洗滌細(xì)胞兩次,最后一次吸干磷酸緩沖液;
2.加入預(yù)冷的RIPA Buffer(1 ml/10^7個(gè)細(xì)胞、10 cm培養(yǎng)皿或150 cm^2培養(yǎng)瓶,0.5 ml/5×10^6個(gè)細(xì)胞、6cm培養(yǎng)皿、75cm培養(yǎng)瓶);
3.用預(yù)冷的細(xì)胞刮子將細(xì)胞從培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶上刮離,把懸液轉(zhuǎn)移到干凈的1.5ml EP管中。并置于低速搖床,4℃緩慢晃動(dòng)15min(EP管插冰上,置水平搖床上);
4.4℃,14000rpm離心15min,立即將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中;
5.將Protein A/G瓊脂糖珠用磷酸緩沖鹽溶液洗兩遍,用磷酸緩沖鹽溶液配制成50%的Protein A/G瓊脂糖珠工作液,建議減掉槍尖部分,避免在涉及瓊脂糖珠的操作中破壞瓊脂糖珠;
6.在樣品中以每1ml中加100μl的比例,加入50%的Protein A/G瓊脂糖珠工作液。水平搖床4℃搖動(dòng)10min(EP管插冰上,置水平搖床上),該步驟的目的是去除非特異性結(jié)合的蛋白;
7.4℃,14000rpm離心15min,將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中,去除Protein A/G瓊脂糖珠;
8.做蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線(Bradford 法),測(cè)定蛋白濃度,測(cè)前將總蛋白至少稀釋1:10倍以上,以減少細(xì)胞裂解液中去垢劑的影響(定量,分裝后,可以在-20℃保存一個(gè)月);
9.用磷酸緩沖液將總蛋白稀釋到1μg/μl以降低裂解液中去垢劑的濃度。如果覺(jué)得你的目的蛋白的濃度低了,可以將總蛋白濃度提高到10μg/μl(假設(shè)濃度足夠);
10.加入一定體積的抗體到500μl總蛋白中,抗體的稀釋比例因與它有作用的蛋白在不同細(xì)胞系中的多少而異;
11.4℃緩慢搖動(dòng)抗原抗體混合物過(guò)夜或室溫2h;激酶或磷酸酯酶活性分析建議用2h室溫孵育;
12.加入100μl Protein A瓊脂糖珠來(lái)捕捉抗原抗體復(fù)合物,4℃緩慢搖動(dòng)抗原抗體混合物過(guò)夜或室溫1h,如果所用抗體為鼠抗或雞抗,建議加2μl過(guò)渡抗體;
13.14000rpm瞬時(shí)離心5s,收集沉淀,并且用預(yù)冷的洗滌緩沖液(或者預(yù)冷的磷酸緩沖鹽溶液)洗滌3遍(每次加入800μl),RIPA Buffer有時(shí)候會(huì)破壞瓊脂糖珠-抗原抗體復(fù)合物內(nèi)部的結(jié)合,可以使用磷酸緩沖鹽溶液;
14.用60μl 2×上樣緩沖液將瓊脂糖珠-抗原抗體復(fù)合物懸起,輕輕混勻,緩沖液的量依據(jù)上樣多少的需要而定(60 μl足夠上三道);
15.以游離抗原,抗體,珠子,離心,將上清電泳,收集剩余瓊脂糖珠,上清也可以暫時(shí)凍-20℃,留待以后電泳,電泳前應(yīng)再次煮5min變性;
通過(guò)免疫共沉淀確定結(jié)合蛋白
1.用磷酸鹽緩沖液洗30塊10 cm培養(yǎng)板上的適宜細(xì)胞。刮去每塊板上的細(xì)胞到1 ml冰冷的EBC裂解緩沖液中;
2.將每毫升細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到微量離心管中,在微量離心機(jī)上4℃以最大速度離心15min;
3.收集上清(約30 ml)并加入30 μg的適當(dāng)抗體,4℃搖動(dòng)免疫沉淀物1 h;
4.加入0.9 ml的瓊脂糖蛋白A懸液,4℃搖動(dòng)免疫沉淀物30 min;
5.用含900 mmol/L NaCl的NETN洗瓊脂糖蛋白A混合物,再重復(fù)洗5次。最后,用NETN洗一次;
6.吸出混合物的液體部分。加入800 μl的1×SDS膠加樣緩沖液到球珠中,煮沸4min;
7.將樣品加入到大孔的不連續(xù)SDS-PAGE梯度膠中,在10mA的恒定電流下電泳過(guò)夜;
8.通過(guò)考馬斯亮藍(lán)染色(測(cè)定蛋白質(zhì)含量屬于染料結(jié)合法的一種)觀察蛋白質(zhì)泳帶;
9.從膠上切下目標(biāo)帶,將其放到微量離心管中,用1ml 50%乙腈洗兩次,每次3 min;
10.用胰蛋白酶消化膠中的蛋白質(zhì),再進(jìn)行電洗脫;
11.通過(guò)窄孔高效液相色譜分離肽。將收集的肽進(jìn)行Edman降解測(cè)序。
(原文地址:www.detaibio.com/topics/mygcd-1.html)
19樓2018-04-28 09:24:48
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