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sxxuan

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Originally posted by wqj1988926 at 2011-02-25 11:19:16:
有可能是緩沖液的時(shí)間太久，我們實(shí)驗(yàn)室有人好像遇到過(guò)這樣的問(wèn)題

嗯，下次我會(huì)注意點(diǎn)的～

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11樓2011-02-25 11:27:14

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silicare(金幣+3): 鼓勵(lì)新蟲(chóng)參與 2011-02-25 13:00:41

首先問(wèn)樓主個(gè)問(wèn)題，你的電泳跑時(shí)電壓時(shí)多少？
然后對(duì)于樓主的PCR電泳圖，我也出現(xiàn)過(guò)類似的情況。
經(jīng)過(guò)個(gè)人總結(jié)，簡(jiǎn)稱“涂布狀條帶”。
產(chǎn)生原因：1.PCR引物特異性不足，PCR擴(kuò)增產(chǎn)生很多雜帶，在電泳時(shí)如果使用大電壓，如120V,130V時(shí)PCR條帶會(huì)跑的很寬，以至于和雜帶連接成一片成涂布狀。
解決方法：1.使用80V左右電壓跑，你可以發(fā)現(xiàn)PCR條帶都被壓的很密集，非特異性擴(kuò)增和目的條帶分的很開(kāi)，不管分析還是回收都可以說(shuō)明了。不過(guò)為了數(shù)據(jù)漂亮，最好重設(shè)引物。

產(chǎn)生原因：2.凝膠沒(méi)有凝好就跑電泳了，遷移率有問(wèn)題，故出現(xiàn)上述情況。
解決方法：2.讓凝膠凝集時(shí)間最好有20分鐘-30分鐘。

產(chǎn)生原因：3.模板污染，一般是污染了基因組DNA，導(dǎo)致相對(duì)引物特異性降低，擴(kuò)增出很多條帶。
解決方法：3。操作嚴(yán)謹(jǐn)，不要污染！個(gè)人覺(jué)得這個(gè)原因，一般注意了就不會(huì)出現(xiàn)。

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12樓2011-02-25 12:56:54

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13樓2011-02-25 13:00:50

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dhd997(金幣+1): 鼓勵(lì)交流 2011-02-25 14:06:23

還忘記問(wèn)個(gè)問(wèn)題了：你這個(gè)是不是融合PCR��？我記得這種PCR很容易出現(xiàn)這個(gè)情況

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14樓2011-02-25 13:01:13

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Originally posted by woshishao at 2011-02-25 12:56:54:
首先問(wèn)樓主個(gè)問(wèn)題，你的電泳跑時(shí)電壓時(shí)多少？
然后對(duì)于樓主的PCR電泳圖，我也出現(xiàn)過(guò)類似的情況。
經(jīng)過(guò)個(gè)人總結(jié)，簡(jiǎn)稱“涂布狀條帶”。
產(chǎn)生原因：1.PCR引物特異性不足，PCR擴(kuò)增產(chǎn)生很多雜帶，在電泳時(shí)如果使用 ...

分析得很詳細(xì)啊，謝謝！
跑電泳的電泳一般都是120V。
引物的特異性怎樣這個(gè)問(wèn)題就難了，因?yàn)橐呀?jīng)換了好幾對(duì)引物了。從12月做到現(xiàn)在一直都沒(méi)有出來(lái)結(jié)果
操作的話，好像也沒(méi)有特別不小心的地方。
至于其中一個(gè)模板確實(shí)是過(guò)年前就準(zhǔn)備好的，放在-80度保存了好久

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15樓2011-02-25 15:47:28

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Originally posted by woshishao at 2011-02-25 13:01:13:
還忘記問(wèn)個(gè)問(wèn)題了：你這個(gè)是不是融合PCR��？我記得這種PCR很容易出現(xiàn)這個(gè)情況

什么是融合PCR？
我做的是先把兩段序列分別擴(kuò)增出來(lái)，然后再用中間引物把兩段序列拼接在一起，成為一個(gè)序列

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16樓2011-02-25 15:49:20

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Originally posted by silicare at 2011-02-25 13:00:50:
換引物吧，是引物降解了

引物是新合成的

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17樓2011-02-25 15:49:58

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Originally posted by sxxuan at 2011-02-25 15:49:58:
引物是新合成的

誰(shuí)說(shuō)新合成就一定好了，引物合成之后是要純化的，純化不好的就出你這種smear

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18樓2011-02-25 17:46:10

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dhd997(金幣+6): good 2011-02-27 10:19:56

看圖，這個(gè)就是融合PCR，你說(shuō)你是把兩個(gè)基因拼成已個(gè)基因，應(yīng)該就是融合PCR了。這種PCR是這樣的，引物特異性問(wèn)題有點(diǎn)不好把握，容易出現(xiàn)這種情況。而且就算擴(kuò)增出目的條帶，也比較淺，建議使用80V來(lái)跑電泳，而且多PCR幾管，有利切膠，樓主可以試下，希望有幫助~~~

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19樓2011-02-26 21:06:28

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dhd997(金幣+1): 歡迎多來(lái)交流 2011-02-27 10:20:14

我讀書(shū)時(shí)也做PCR，現(xiàn)在工作幾年，忘光了，呵呵，心有余而力不足已。

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20樓2011-02-27 10:00:25

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