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簡(jiǎn)0516單至尊木蟲 (著名寫手)
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[求助]
做過RNAi或者實(shí)時(shí)定量的同學(xué)請(qǐng)幫助我解決一個(gè)問題，感激不盡
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最近在做RNAi，我的實(shí)驗(yàn)對(duì)象是秀麗隱桿線蟲，采用的干擾方式是浸泡，將體外轉(zhuǎn)錄獲得的dsRNA通過浸泡的方式導(dǎo)入線蟲體內(nèi)，收集蟲體后提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA之后做實(shí)時(shí)定量檢測(cè)干擾效果。可定量結(jié)果讓我很頭疼，目的基因的拷貝數(shù)不僅沒有降低，反而升高了。如果說目的基因的拷貝數(shù)沒有明顯下降，可以解釋為干擾效果不好，但是目的基因的拷貝數(shù)明顯上升，這怎么解釋？希望高手可以幫我解釋一下這個(gè)現(xiàn)象，感激不盡~~~ 我個(gè)人認(rèn)為，可能是浸泡后的蟲體內(nèi)殘留有dsRNA，是不是因?yàn)樵谶M(jìn)行總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄的時(shí)候?qū)埩舻膁sRNA也一并提出并合成了cDNA，從而導(dǎo)致目的基因的拷貝數(shù)增加？如果這種推測(cè)成立，那么，在提取總RNA之前應(yīng)該怎樣對(duì)蟲體進(jìn)行處理，以消除dsRNA的干擾？ 我做的是相對(duì)定量，每次都做三個(gè)重復(fù)，以管家基因的拷貝數(shù)作為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算目的基因的相對(duì)含量，可是實(shí)驗(yàn)組的目的基因含量每次都比陰性對(duì)照組高。另外，我本次干擾一共做了三個(gè)不同的基因，貌似三個(gè)不同的基因都出現(xiàn)了這樣的情況，讓人很費(fèi)解，求幫助~~~ [ Last edited by 1949stone on 2011-5-30 at 16:24 ] |
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西瓜
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秀麗隱桿線蟲的話，用喂食的方法做RNAi更方便��！ 把你要干擾的基因的CDS選一段約1kb的片段，克隆到L4440質(zhì)粒里，再轉(zhuǎn)到HT115菌株里，用來喂食線蟲就可以了。L4440有兩個(gè)反向的T7啟動(dòng)子，可以直接表達(dá)雙鏈RNA,線蟲吃進(jìn)去后該雙鏈RNA會(huì)被降解成小片段，可以介導(dǎo)RNA干擾的。你要好好看看Andrew Fire的文章了。L4440質(zhì)粒的信息在下面： http://www.addgene.org/pgvec1?f= ... amp;identifier=1654 定量的問題也容易解決，你設(shè)計(jì)引物的時(shí)候避開你的dsRNA就可以了。讓擴(kuò)增的序列不在dsRNA的區(qū)域里就ok啦。 |
9樓2011-06-02 23:12:06
seahow
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★
簡(jiǎn)0516單(金幣+5): 謝謝你的建議，我現(xiàn)在正在設(shè)計(jì)western的方案。 2011-05-31 15:11:55
西瓜(金幣+3): 歡迎應(yīng)助 2011-06-02 23:14:41
簡(jiǎn)0516單(金幣+5): 謝謝你的建議，我現(xiàn)在正在設(shè)計(jì)western的方案。 2011-05-31 15:11:55
西瓜(金幣+3): 歡迎應(yīng)助 2011-06-02 23:14:41
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首先，確定你的實(shí)驗(yàn)沒有誤差，沒有技術(shù)問題（我覺得應(yīng)該沒有）；同時(shí)，建議你做western ，這樣才是最終結(jié)果。 第二， 你要清楚RNAi未必會(huì)抑制轉(zhuǎn)錄，激活轉(zhuǎn)錄也是可以的，這是一種反饋效應(yīng)！ 所以，如果 你需要這個(gè)抑制，你應(yīng)該選擇其他位點(diǎn)設(shè)計(jì)，或許有效果。 |
7樓2011-05-31 14:36:59
terry130
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【答案】應(yīng)助回帖
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簡(jiǎn)0516單(金幣+5): 謝謝你的建議 2011-05-31 18:32:10
西瓜(金幣+3): 鼓勵(lì)交流 2011-06-02 23:14:56
簡(jiǎn)0516單(金幣+5): 謝謝你的建議 2011-05-31 18:32:10
西瓜(金幣+3): 鼓勵(lì)交流 2011-06-02 23:14:56
| 如果重復(fù)三次都是處理組比陰性對(duì)照組高的話就應(yīng)該可以排除你實(shí)驗(yàn)操作的誤差了。你自己的懷疑有道理，想排除的話也很容易，你的對(duì)照組也用dsRNA泡一下就可以了，只不過選擇的dsRNA是無義的就好了。另外還有一種可能，生物體內(nèi)的基因表達(dá)是一張網(wǎng)絡(luò)，某個(gè)基因的表達(dá)變化往往會(huì)導(dǎo)致其他基因的表達(dá)水品也發(fā)生變化。你應(yīng)該用你的dsRNA序列去線蟲基因庫(kù)內(nèi)blast一下，看看除了你的目的基因外，這個(gè)siRNA是否還有其他靶點(diǎn)，如果沒有的話沒問題，如果有的話就可能是其他靶基因受抑制后對(duì)你的目的基因的表達(dá)產(chǎn)生激活的作用。 |
8樓2011-05-31 15:16:06
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10樓2012-03-01 12:38:28
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