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太極拳

木蟲 (小有名氣)

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【答案】應(yīng)助回帖

★ ★ ★
西瓜(金幣+3): 歡迎交流經(jīng)驗(yàn) 2011-06-08 18:58:01

我也曾經(jīng)出現(xiàn)過此問題，后來用的Transgene的PEasy-T1載體，是一種混合液，如果是20次的載體，只需分裝成20支PCR小管里，每支管中加入連接產(chǎn)物4ul即可，如果連接產(chǎn)物濃度高可以少加，用ddH2O補(bǔ)加到4ul。連接溫度25℃（PCR儀中進(jìn)行），1K以下5min，1K-2K連接10min，2K以上15-20min即可。載體上有雙抗性amp和kan，可先用一種抗性平板涂板，之后挑斑到另一抗性液體培養(yǎng)基中搖菌，基本全是陽性。藍(lán)白斑可做可不做。成功率達(dá)到90%以上。希望對樓主有用。

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11樓2011-06-08 12:12:26

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菜菜的夏子

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Originally posted by 西瓜 at 2011-06-07 23:20:46:
陽性對照ok的話，那連接出問題的可能比較大啦。建議你把連接步驟詳細(xì)說下。
我們實(shí)驗(yàn)室的話，如果連接屢次不成，會直接重新做連接底物，PCR重做，載體也重新切。PCR產(chǎn)物用試劑盒純化，載體酶切之后膠回收純化，不 ...

首先PCR后跑電泳檢測，全部上樣，割膠回收。然后連接。
連接我做了兩組（均為TaKaRa產(chǎn)品）：
1、 10xT4連接Buffer    1ul
   pMD 18 T 載體    1ul
   T4 DNA 連接酶    1ul
   割膠回收PCR產(chǎn)物 7ul

2、 pMD 18 T 載體    1ul
   割膠回收PCR產(chǎn)物    4ul
   Solution 1                5ul

兩者均為16攝氏度連接過夜，我還怕溫度不準(zhǔn)，放在了PCR儀里，取出來時(shí)看了時(shí)間，14個(gè)小時(shí)多，按理說肯定該連接好了。但是轉(zhuǎn)化大腸桿菌后不長。

PCR我也是重新做的，就是想著用新鮮的PCR產(chǎn)物，載體是問別人借的，因?yàn)閷?shí)驗(yàn)室正好用完了，但是別人每次都可以連接成功的……所以我就搞不懂是哪里的問題了，難道是我的酶有問題？

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12樓2011-06-08 14:38:43

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菜菜的夏子

銅蟲 (小有名氣)

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Originally posted by healerly at 2011-06-08 08:26:47:
連接按照試劑盒做的話一般都沒問題~~最近用Takara的試劑盒做連接，效果總算好點(diǎn)了，我做的時(shí)候也是連接處問題，原因可能是水浴鍋連的吧~~水浴鍋要控制在16度需要加冰·~我本人感覺這樣就不準(zhǔn)了~~所以最后還是果斷 ...

我就是用的Takara的試劑盒做的連接，也是怕溫度不準(zhǔn)，放在了PCR儀里16度反應(yīng)過夜了，可還是沒成功。
電泳我倒是沒有跑，這個(gè)我再試試。
PCR產(chǎn)物我也純化了，還害怕有別的因素影響，我全部上樣后割膠回收純化的，感覺應(yīng)該還好呀！說到這里我想起來割膠回收后忘了跑電泳看看了，或者是割膠回收的試劑盒太久了……請問這個(gè)有可能嗎？
連接我做了兩組（均為TaKaRa產(chǎn)品）：
1、 10xT4連接Buffer    1ul
   pMD 18 T 載體    1ul
   T4 DNA 連接酶    1ul
   割膠回收PCR產(chǎn)物 7ul

2、 pMD 18 T 載體    1ul
   割膠回收PCR產(chǎn)物    4ul
   Solution 1                5ul

兩者均為16攝氏度連接過夜，放在PCR儀里，取出來時(shí)看了時(shí)間，14個(gè)小時(shí)多，按理說肯定該連接好了。但是轉(zhuǎn)化大腸桿菌后不長。

不知是我的酶失效了，還是割膠回收試劑盒失效了……我去跑個(gè)電泳看看，謝謝你的答復(fù)

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13樓2011-06-08 14:44:56

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Originally posted by zj408694018 at 2011-06-08 08:41:23:
用Takara的試劑盒做連接，然后放到PCR儀里面，時(shí)間久點(diǎn)
還有就是要是你連續(xù)連接超過三次都不行的話最好考慮換酶，PCR和酶切的酶
我的也是連接了好久一直連接不上，但是最近換了PCR的酶之后很順利，連著連接上兩 ...

嗯，我再試試，不行將所有的酶和純化試劑盒換一遍試試看。
謝謝你的建議

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14樓2011-06-08 14:56:11

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Originally posted by beautybanana at 2011-06-08 08:44:46:
pMD18-T vector ligation system
pMD18-T                      1uL
DNA template       4uL
Solution I                      5uL
Total                      10uL
將純化的PCR產(chǎn)物與T載體連接重 ...

我陽性對照可以長出來的啊！大概涂板后8小時(shí)就長出來了，很多菌落。所以我覺得我的感受態(tài)細(xì)胞是沒有問題的。我會懷疑是連接的地方問題大些。

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15樓2011-06-08 14:58:14

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Originally posted by poog502 at 2011-06-08 08:49:55:
順便提一下
pMD18-T vector載體的鏈接效率很低，如果總是做不出來，可以用promega的T easy載體。

嗯嗯，是�。∥矣胮MD18-T vector或者pMD19-T vector，做連接總是不成功，我都懷疑自己操作太差了，但是聽別人說效果還可以呀！為什么我就做不出來呢？

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16樓2011-06-08 15:00:21

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Originally posted by 飄在海上的雪 at 2011-06-08 08:58:26:
我一直用takara的PMD19-T，一般沒出現(xiàn)過什么問題，在4度連接過夜，如果片段稍長，就多連接一天...

我的片段有700多bp，貌似這樣大小的片段還比較好連的呀！不過我是16度連接過夜的，我覺得效果應(yīng)該也很好的，就是經(jīng)常做不出來……唉

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17樓2011-06-08 15:01:30

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Originally posted by sfb1020 at 2011-06-08 10:05:21:
是不是你回收的目的基因不純，有雜質(zhì)會影響連接反應(yīng)。

我是割膠回收的，我跑上電泳了，看看是不是我的凝膠回收試劑盒出問題了。我想起來我的凝膠回收試劑盒里的Buffer DE-B蓋子上全是結(jié)晶，不知道會不會影響割膠回收的效率？不過感覺還好，加了DE-A后凝膠很快就融化掉了，大約只要2分鐘吧，而且切回來的膠我都沒有切碎，整塊溶解的，很快就溶解掉了。加進(jìn)DE-B后也是立刻就變?yōu)辄S色液體了，所以我一直沒懷疑割膠回收試劑盒的問題。
對了，我的凝膠回收試劑盒是AXYGEN公司的。

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18樓2011-06-08 15:05:46

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★ ★ ★
西瓜(金幣+3): 很認(rèn)真學(xué)習(xí)啊，一并鼓勵(lì)下～ 2011-06-08 18:58:27

引用回帖:

Originally posted by shine372 at 2011-06-08 10:41:57:
pMD19-T vector ligation system
pMD19-T                      1uL
DNA                            7uL
T4DNA連接酶                0.5uL
緩沖液                         1uL
DD水          ...

我是這樣做的。
首先PCR后跑電泳檢測，全部上樣，割膠回收。然后連接。
連接我做了兩組（均為TaKaRa產(chǎn)品）：
1、 10xT4連接Buffer    1ul
   pMD 18 T 載體    1ul
   T4 DNA 連接酶    1ul
   割膠回收PCR產(chǎn)物 7ul

2、 pMD 18 T 載體    1ul
   割膠回收PCR產(chǎn)物    4ul
   Solution 1                5ul

(1) 16℃過夜（超過12h），全量（10uL）轉(zhuǎn)化至100ul新鮮制備，冰浴放置12h-16h的E.coli DH5α的感受態(tài)細(xì)胞，冰浴30min。
(2) 37℃水浴熱激5min（老師說42度90s或者37度5min都可以，我是覺得5min更好控制）后，立即再冰浴2-3min。
(3) 加入900μL LB液體培養(yǎng)基，37℃ 培養(yǎng)1-2h。
(4) 離心，棄900ul上清，將剩余100μL混勻菌液，涂布含Amp的LB固體培養(yǎng)基平板， 37℃ 培養(yǎng)8-14h 。
陽性對照8小時(shí)候就長了，我的樣品現(xiàn)在早過了14h，還是一個(gè)菌落也沒有……

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19樓2011-06-08 15:12:19

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【答案】應(yīng)助回帖

★ ★ ★
西瓜(金幣+3): 鼓勵(lì)交流.我們一般墊保鮮膜，呵呵～ 2011-06-08 18:59:09

引用回帖:

Originally posted by 菜菜的夏子 at 2011-06-08 15:05:46:
我是割膠回收的，我跑上電泳了，看看是不是我的凝膠回收試劑盒出問題了。我想起來我的凝膠回收試劑盒里的Buffer DE-B蓋子上全是結(jié)晶，不知道會不會影響割膠回收的效率？不過感覺還好，加了DE-A后凝膠很快就融化 ...

回收后的效率可以點(diǎn)10微升，跑個(gè)電泳看看你到底回收起來了沒有。愛思進(jìn)的膠回收試劑盒質(zhì)量很好的。通常是4度回收連接過夜，只有takara的是16度，但我們一直用的是4度冰箱過夜(>16 h)。膠回收的時(shí)候記得在凝膠下面墊一個(gè)PE手套，防止其他小片段也被你回收上來了。

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20樓2011-06-08 15:16:26

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