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pumpkin236

鐵蟲(chóng) (小有名氣)

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引用回帖:

Originally posted by spiderboy at 2011-06-16 18:25:44:
1、轉(zhuǎn)染后24H有點(diǎn)少了吧。我們實(shí)驗(yàn)室都是2-3天。
2、LIPO毒性大是肯定的。但是不同細(xì)胞不太一樣。你再看看你的細(xì)胞是否很易感。
3、RT和WT都要做，說(shuō)服力強(qiáng)。
4、最重要的，你設(shè)計(jì)的SIRNA要用相關(guān)軟件評(píng)估下， ...

轉(zhuǎn)染后兩三天，會(huì)不會(huì)敲出的效果就恢復(fù)了啊？

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11樓2011-06-23 16:37:23

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zhuqiushi

至尊木蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)

Juventus

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【答案】應(yīng)助回帖

pumpkin236(金幣+1): 2011-06-26 20:23:04

引用回帖:

Originally posted by pumpkin236 at 2011-06-23 16:36:27:
我沒(méi)有摸條件，直接用的實(shí)驗(yàn)室常用的條件，一般24-36小時(shí)后提取RNA做RT-PCR。
但是第一次做的效果很不好，所以打算在做一次。

摸條件時(shí)，是不siRNA：lipo 是不變的？只是同時(shí)改變它們的濃度？

我們做的RNA干擾是把稀釋后的siRNA直接注射進(jìn)活體動(dòng)物的特定組織后，過(guò)6、12、24、36、48、60、72、84、96h后從該組織處提取RNA進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)然后再以對(duì)照組做比較來(lái)檢測(cè)RNA干擾的效率（快2年沒(méi)做了，大概是這么個(gè)過(guò)程），我們沒(méi)有在細(xì)胞水平做過(guò)，所以對(duì)于細(xì)胞轉(zhuǎn)染時(shí)的條件摸索我不大清楚

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日子就是問(wèn)題疊著問(wèn)題，要挺胸抬頭去面對(duì)

12樓2011-06-24 12:59:09

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pumpkin236

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引用回帖:

Originally posted by silicare at 2011-06-15 08:25:36:
siRNA不好做，對(duì)于新手可以選擇更好控制的shRNA，shRNA是雙鏈DNA構(gòu)建載體，比較好操作

干擾序列一般要選3段，不建議自己設(shè)計(jì)，成功率低，你可以到NCBI 的探針庫(kù)去找，或者查文獻(xiàn)找現(xiàn)成的

lipo2000的毒性眾所 ...

我做了塊兩個(gè)月了，老出問(wèn)題。轉(zhuǎn)染后4h換液后，過(guò)一段時(shí)間就有好多漂浮物，不像死細(xì)胞，倒像是染菌。但是已經(jīng)排除是培養(yǎng)基的問(wèn)題。不知道你遇到過(guò)這種問(wèn)題么。。

謝謝了。。。

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13樓2011-06-27 09:27:33

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silicare

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【答案】應(yīng)助回帖

引用回帖:

Originally posted by pumpkin236 at 2011-06-27 09:27:33:
我做了塊兩個(gè)月了，老出問(wèn)題。轉(zhuǎn)染后4h換液后，過(guò)一段時(shí)間就有好多漂浮物，不像死細(xì)胞，倒像是染菌。但是已經(jīng)排除是培養(yǎng)基的問(wèn)題。不知道你遇到過(guò)這種問(wèn)題么。。

謝謝了。。。

怎么判斷是染菌？

怎么排除的培養(yǎng)基問(wèn)題？

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14樓2011-06-27 11:59:30

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引用回帖:

Originally posted by silicare at 2011-06-27 11:59:30:
怎么判斷是染菌？

怎么排除的培養(yǎng)基問(wèn)題？

我把所使用的培養(yǎng)基放到培養(yǎng)皿中培養(yǎng)沒(méi)發(fā)現(xiàn)異常。而且轉(zhuǎn)染幾小時(shí)候發(fā)現(xiàn)飄起來(lái)的好多一團(tuán)一團(tuán)的東西，而且時(shí)間越久越多，我4h后換液再培養(yǎng)還是會(huì)出現(xiàn)類(lèi)似情況。并且正常組也會(huì)出現(xiàn)同樣的情況（對(duì)照組轉(zhuǎn)染時(shí)，正常組也換成了無(wú)血清的培養(yǎng)基）。同時(shí)我用喊5%血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞就不會(huì)出現(xiàn)類(lèi)似情況。

現(xiàn)在很頭疼，不知道什么問(wèn)題，想的是不是因?yàn)檗D(zhuǎn)染時(shí)候用的無(wú)血清培養(yǎng)基細(xì)胞受不了，但是如果換含血清的培養(yǎng)基，又不利于轉(zhuǎn)染。。。。

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15樓2011-06-27 16:59:17

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【答案】應(yīng)助回帖

這種情況就需要你多做對(duì)照排除原因了
不過(guò)還是首先要懷疑毒性
污染的概率不大，即便污染也不會(huì)是你看到的情況

做個(gè)只有l(wèi)ipo的對(duì)照
做個(gè)只有質(zhì)粒的對(duì)照，看看內(nèi)毒素情況，雖然這種概率很低很低
6孔板轉(zhuǎn)染的話(huà)2-3ul lipo也能得到很好的轉(zhuǎn)染效果，你甚至可以試試1ul

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pumpkin236

16樓2011-06-27 17:11:52

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引用回帖:

Originally posted by silicare at 2011-06-27 17:11:52:
這種情況就需要你多做對(duì)照排除原因了
不過(guò)還是首先要懷疑毒性
污染的概率不大，即便污染也不會(huì)是你看到的情況

做個(gè)只有l(wèi)ipo的對(duì)照
做個(gè)只有質(zhì)粒的對(duì)照，看看內(nèi)毒素情況，雖然這種概率很低很低
6孔板轉(zhuǎn)染的 ...

太感謝你了。。下午實(shí)驗(yàn)我就試一下。。謝謝了

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17樓2011-06-28 09:15:56

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【答案】應(yīng)助回帖

引用回帖:

Originally posted by zhuqiushi at 2011-06-24 12:59:09:
我們做的RNA干擾是把稀釋后的siRNA直接注射進(jìn)活體動(dòng)物的特定組織后，過(guò)6、12、24、36、48、60、72、84、96h后從該組織處提取RNA進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)然后再以對(duì)照組做比較來(lái)檢測(cè)RNA干擾的效率（快2年沒(méi)做了，大概是這 ...

要確定是否染菌，你可以做下DAPI染色和革蘭氏染色。另外，可以取一點(diǎn)你的培養(yǎng)產(chǎn)物放在LB平板上，看看是否長(zhǎng)。

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18樓2011-06-28 12:19:48

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【答案】應(yīng)助回帖

設(shè)計(jì)siRNA要考慮很多因素，比如是否和合適的位點(diǎn)配對(duì)，不能和種子序列配對(duì)，不能和靠近兩端的序列配對(duì)，否則都會(huì)影響沉默效率。
設(shè)計(jì)的siRNA末端可以加兩個(gè)T,以增加結(jié)合的穩(wěn)定性。
具體設(shè)計(jì)siRNA的的注意事項(xiàng)文獻(xiàn)中都有。
轉(zhuǎn)染時(shí)的無(wú)菌操作也各種小心吧，其中混合要均勻，時(shí)間有要求的一定要嚴(yán)格。
我也是用的同樣的轉(zhuǎn)染試劑，效果挺好的，
lz加油吧~

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19樓2011-06-28 12:53:59

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pumpkin236

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1212380樓: Originally posted by spiderboy at 2011-06-16 18:25:44:
1、轉(zhuǎn)染后24H有點(diǎn)少了吧。我們實(shí)驗(yàn)室都是2-3天。
2、LIPO毒性大是肯定的。但是不同細(xì)胞不太一樣。你再看看你的細(xì)胞是否很易感。
3、RT和WT都要做，說(shuō)服力強(qiáng)。
4、最重要的，你設(shè)計(jì)的SIRNA要用相關(guān)軟件評(píng)估下， ...

你好，以前請(qǐng)教過(guò)你siRNA的問(wèn)題，最近又遇到問(wèn)題想問(wèn)下，最近買(mǎi)的dramcom現(xiàn)成的siRNA，發(fā)現(xiàn)24h，按lipo推薦的比例，發(fā)現(xiàn)沉默效果幾乎沒(méi)有。想摸下lipo：siRNA的比例。
1 想問(wèn)下，摸條件的時(shí)候，如果用24孔板，比較省試劑，但是如果做RT-PCR，24孔板怎么提RNA呢。我手上的步驟都是6孔板的提RNA的相關(guān)步驟
2 我買(mǎi)的siRNA試劑的時(shí)候，是四條siRNA混合裝的，給了四條siRNA的序列。但是我想選出兩條最優(yōu)的讓試劑公司給合成。你知道哪個(gè)軟件可以篩選siRNA序列不？

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20樓2012-03-26 16:59:22

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