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silicare

榮譽版主 (文壇精英)

合伙創(chuàng)業(yè)版兼職版主

BioEPI: 14
應助: 88 (初中生)
貴賓: 29.823
金幣: 18946.3
散金: 24272
紅花: 300
沙發(fā): 88
帖子: 10222
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蟲號: 948825
注冊: 2010-01-26
專業(yè): 摩尼教
管轄: 新藥研發(fā)

【答案】應助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
lstt09nk(金幣+10, BioEPI+1): 難得看你碼這么多字，看來給錢還是管用的~~ 2011-09-17 13:14:35
qinjie1211(金幣+200): 謝謝您�。� 2011-09-17 19:44:58
qinjie1211(金幣+1): 環(huán)丙沙星可以殺支原體污染嗎？ 2011-09-17 19:46:12

如果是懷疑支原體的話，最佳方法就是做個爬片，用hochest 33342 33258等核酸熒光染料染色，如果污染，支原體就會在細胞周圍看到藍色的熒光小點，如果沒有，則只有細胞的細胞核顯色

沒污染的

污染的

舉個例子：

DNA螢光染色法
·  原理︰利用螢光染劑（bisbenzimide, Hoechst 33258）偵測支原體污染。此染劑會結(jié)合到DNA之Adenosine-Thymidine (A-T) rich區(qū)域，因為支原體之DNA中A-T含量占多數(shù)（55～80%），所以可將其染色而偵測。被支原體污染之細胞經(jīng)染色后，在細胞核外與細胞周圍可看到許多大小均一之螢光小點，即為支原體之DNA，證明有支原體之污染。
·  測試步驟用間接步驟，將待測細胞懸浮液或細胞培養(yǎng)液接種于指示細胞培養(yǎng)液中（indicator cell，例如Vero cell or 3T6 cell），然后培養(yǎng)指示細胞再作螢光染色。正負反應對照組亦可以接種于indicator cell內(nèi)作為對照。
·  待測細胞亦可作直接測試，但需為吸附型細胞，培養(yǎng)后直接作螢光染色。有些細胞易有螢光背景，而干擾結(jié)果判讀，則建議使用接種于指示細胞之步驟。
·  特點︰簡單、經(jīng)濟與靈敏，廣泛使用，可作為例行之偵測步驟�？梢詡蓽y不易培養(yǎng)之支原體，例如M. hyorhinis，較直接培養(yǎng)法快，約一星期即可知道結(jié)果。
·  缺點：有時仍會有螢光背景，影響判讀。
材料︰
·  Hanks’ balanced salt solution without NaHCO3 or phenol red (HBSS, GibcoBRL 21250-014﹚、bisbenzimide (Hoechst No.33258, Sigma B-2883)、thimerosol (Sigma T-5125)、0.1M citric acid、02M disodium phosphate、glycerol、glacial acetic acid、methanol、strerile H2O、chamber slide (Nunc 177380)或chamber slide替代物：35 or 60mm sterile plate內(nèi)放置無菌22x22mm蓋玻片﹙浸于酒精內(nèi)，使用前過火滅菌﹚，一般吸附型細胞均能吸附在蓋玻片上。染色后取出蓋玻片，細胞面朝下放在玻片上觀察。
·  Indicator cells: Vero (African green monkey kidney, ATCC CCL-81 or CCRC 60013) or 3T6(mouse fibroblast, ATCC CCL-96 or CCRC 60070)，細胞須先測試無污染。αMEM with 10%FBS ( medium for Vero cell)
配制試劑:
·  無菌HBSS︰配制Hanks’ balanced salt solution，以0.22mm無菌過濾膜過濾滅菌。勿用高壓蒸汽滅菌。
·  Hoechst 33258 stock solution（100X）︰稱取5.0 mg bisbenzimide和10.0 mg thimersol溶于100 ml無菌HBSS，置于棕色瓶中，室溫下以電磁攪拌器攪拌30分鐘至完全溶解后，以1ml分裝至1.5ml小離心管中，貯存于-20℃。
·  Hoechst 33258 working reagent︰取1 ml Hoechst 33258 stock solution，加入sterile 100 ml HBSS中，室溫下攪拌45分鐘，置于棕色瓶中并以鋁箔紙包覆，避免光照，貯存于4℃。
·  mounting solution︰22.2 ml 0.1 M citric acid和27.8 ml 0.2 M Na2HPO4加入于50 ml glycerol中混合，以1 N NaOH調(diào)整pH至5.5（pH很重要），貯存于4℃。
·  固定溶液（fixative）︰冰醋酸與甲醇以1︰3之體積比例混合，使用前才配制。
步驟：
·  培養(yǎng)Vero細胞： Vero細胞可作長期培養(yǎng)或制作多個冷凍保存管，測試前解凍培養(yǎng)。測試前一周培養(yǎng)Vero細胞。
·  在接種測試樣品前一日，以trypsin-EDTA溶液處理Vero細胞，制成細胞懸浮液，以1~2x10^4 cells／ml培養(yǎng)于chamber slide中，每個well加入1ml細胞懸浮液，于37℃, 5％CO2培養(yǎng)。隔日確定生長良好后，即可接種測試樣品。
·  接種測試樣品：樣品種類：1ml待測之培養(yǎng)基，1ml待測細胞培養(yǎng)液（可將細胞稍微刮下﹚，0.05~0.1ml冷凍管之細胞懸浮液。
·  將測試樣品加入chamber slide內(nèi)，培養(yǎng)5天后，進行Hoechst 33258的螢光染色觀察。
·  以Acholeplasma laidlawii ATCC 23206 感染Vero細胞作為正反應對照組﹙或是已感染支原體之細胞培養(yǎng)液或冷凍細胞液﹚，負反應對照組為Vero cell之新鮮培養(yǎng)基( αMEM +10%FBS)。
DNA螢光染色檢測︰
·  取出培養(yǎng)5日之Vero細胞，吸除培養(yǎng)液。于每個well中加入2 ml 1:3混合的冰醋酸/甲醇固定液，靜置10 min后，吸除固定液。重復上述之步驟，風干10分鐘。
·  于每個well中，加入1 ml Hoechst 33258 working solution，室溫下靜置30 min。
·  吸掉Hoechst 33258染液后，以無菌水洗滌3次，風干后加入1滴的mounting solution，并以蓋玻片覆蓋之。
·  以100x-400x螢光顯微鏡觀察。打開水銀光源10 min后，以UV激發(fā)光束(330～380 nm)之濾光鏡，觀察細胞核外是否有藍色螢光小點或是絲狀點之螢光物產(chǎn)生。
結(jié)果判讀︰
若有支原體污染，在Vero細胞核外與細胞表面會出現(xiàn)藍色螢光小點或是絲狀點。其形狀一致，與細胞殘片染成之不規(guī)則點狀物不同。其螢光可維持數(shù)星期。

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11樓2011-09-17 10:56:05

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song-20060

木蟲 (職業(yè)作家)

Gattuso

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【答案】應助回帖

細胞不好產(chǎn)生的空泡

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此刻，你心里想起誰？

12樓2011-09-17 15:34:52

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linerman

木蟲 (小有名氣)

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【答案】應助回帖

是不是培養(yǎng)基的沉淀結(jié)晶？

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13樓2011-09-17 16:09:44

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linerman

木蟲 (小有名氣)

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【答案】應助回帖

是不是在孵箱放時間長了，培養(yǎng)基內(nèi)一些成分形成的沉淀結(jié)晶物？

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14樓2011-09-17 16:13:58

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seuman1

15樓2011-09-17 16:40:34

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luckyspoony

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【答案】應助回帖

qinjie1211(金幣+1): 沒滅過活的，做免疫學實驗才需要滅活的 2011-09-17 19:39:03

引用回帖:

1樓: Originally posted by qinjie1211 at 2011-09-15 19:52:55:
妊娠的滋養(yǎng)細胞，培養(yǎng)了兩天左右發(fā)現(xiàn)胞漿內(nèi)細胞核周圍有一圈黑點，是營養(yǎng)不足還是支原體污染呢？血清絕對沒問題，用的是以色列BioInd的特級胎牛血清，養(yǎng)其他細胞都很好的。請各位朋友支支招， ...

那這個黑點是否影響到細胞的生長了呢？還有你的胎牛血清在使用前是否有進行滅活過?我記得說：如果血清有進行滅活過會產(chǎn)生一些黑點類似物，這是因為血清滅活之后會使沉淀物增加，這些沉淀物在倒置顯微鏡下觀察時會看到一些黑點物質(zhì)。
這只是我個人淺解，不知道能否幫您理解~~~還有支原體污染貌似是看不見的，發(fā)生支原體污染的癥狀是細胞生長狀態(tài)越來越差時可以懷疑支原體污染，具體是不是還要做細菌試驗的~~~

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機會永遠只垂青有準備的人！

16樓2011-09-17 17:27:46

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380218013

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引用回帖:

1538636樓: Originally posted by dongfang5715 at 2011-09-17 09:43:04:
是不是二氧化碳不夠了然后細胞變壞了

你好：我想確認一下二氧化碳不夠了，細胞中會產(chǎn)生黑點——可能會運動也可能是布朗運動型的。因為最近我的細胞中也出現(xiàn)這黑點了，很多不知道如何控制煩啊

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好好生活，努力賺錢

17樓2012-04-11 10:19:58

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gengfeng

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我用的也是這個牌子的血清，然后是同樣的問題，細胞內(nèi)黑點比較多，然后不愛張慢慢的死去了！郁悶�。∮腥苏f是血清滅活后的產(chǎn)物不知道是不是！

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18樓2015-06-01 10:37:05

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走路的麻雀

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【答案】應助回帖

我培養(yǎng)的上皮細胞也是這樣我用了生長因子不知道你用不用我覺得可能是

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19樓2015-06-01 16:42:42

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