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32樓: Originally posted by 若水5886 at 2012-02-22 12:21:09
首先你要確定你的PCR產(chǎn)物是新鮮的，載體選擇的是對(duì)的（平端和粘性末端的選擇），感受態(tài)是好的，還有連接的溫度低了，我用的全式金5分鐘快速克隆產(chǎn)品，25-37度這樣連接十分鐘左右就可以的。還有你說的載體和PCR產(chǎn)物比 ...

你好我遇到了和樓主相似的問題，只是我目的條帶263bp（Taq酶），我用的是PMD-18。 solution : 5ulpmd-18/19T： 1ul片段：4ul，Takara 的感受態(tài)，都是100ul做兩只樣，涂板（只用30ul菌液）培養(yǎng)后菌很多啊，但是挑了十來個(gè)菌落做pcr鑒定都沒有目的條帶。開始只做的Amp篩選，后來加了X-ga，IPTG，但根本看不到藍(lán)白班現(xiàn)象，挑菌pcr也無果。請(qǐng)你說說看

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51樓2013-03-28 07:32:43

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做TA克隆時(shí)，直接用PCR產(chǎn)物跟pMD18載體連接，我的PCR產(chǎn)物結(jié)果較好，目標(biāo)片段長(zhǎng)度263bp，電泳時(shí)看不出非特異擴(kuò)增，有引物二聚體。1ul載體，4ulpcr產(chǎn)物，5ul自帶的solutionI混合，16度連接過夜，42度熱激45秒，冰上2分鐘導(dǎo)入感受態(tài)DH5a搖床培養(yǎng)1小時(shí)后，在含X-gal，IPTG，Amp的LB固體培養(yǎng)基平板篩選，看不到藍(lán)白班，但有許多單菌落，挑單菌落于含1ml LB液體培養(yǎng)基的試管中搖菌10小時(shí)，用菌液PCR檢測(cè)（所用引物于前面pcr的引物相同，反映條件也相同，只是94度預(yù)變性時(shí)間改為10分鐘）。但是檢測(cè)結(jié)果沒有目的條帶，只有100bp左右的引物二聚體。載體說明書上說16度半小時(shí)就可以連接上了，師兄說連接過夜試一下，都沒有結(jié)果。
而且載體，感受態(tài)都是TaKara的，新買的。我是一個(gè)菜鳥，不知道說的夠不夠詳細(xì)，請(qǐng)大家?guī)臀曳治龇治鍪鞘裁丛�。拜謝。

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52樓2013-03-28 12:27:51

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加一個(gè)參照一起轉(zhuǎn)化看一下是連接轉(zhuǎn)化效率低還是感受態(tài)問題，一般來說連接轉(zhuǎn)化就是相對(duì)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化少，但是沒有也不應(yīng)該

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53樓2013-03-28 15:09:35

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補(bǔ)點(diǎn)ATP試試 10mM的加1μl就可以了

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54樓2013-03-28 17:37:25

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52樓: Originally posted by 生物生物 at 2013-03-28 12:27:51
做TA克隆時(shí)，直接用PCR產(chǎn)物跟pMD18載體連接，我的PCR產(chǎn)物結(jié)果較好，目標(biāo)片段長(zhǎng)度263bp，電泳時(shí)看不出非特異擴(kuò)增，有引物二聚體。1ul載體，4ulpcr產(chǎn)物，5ul自帶的solutionI混合，16度連接過夜，42度熱激45秒，冰上2分 ...

能夠在AMP平板上長(zhǎng)出許多菌落，說明轉(zhuǎn)化時(shí)沒有問題的，只是空載而已，那就是問題出現(xiàn)在連接上。
1）你的PCR產(chǎn)物是不是經(jīng)過割膠回收純化后  再連接的？如果是，確信你回收回來沒有，要檢測(cè)的，微量紫外或者跑膠都可以
  建議：用TAE膠回收，效果會(huì)好于TBE
2）現(xiàn)在takara  有個(gè)專賣 solution 的試劑盒，里面有個(gè)solution III，據(jù)說可以顯著提高連接效率。載體我們都是稀釋10倍用的，配這個(gè)試劑盒，會(huì)節(jié)省很多成本哦。

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55樓2013-03-29 16:14:20

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49樓: Originally posted by 生物生物 at 2013-03-28 07:31:45
你好我遇到了和樓主相似的問題，只是我目的條帶263bp（Taq酶），我用的是PMD-18。 solution : 5ulpmd-18/19T： 1ul片段：4ul，Takara 的感受態(tài)，都是100ul做兩只樣，涂板（只用30ul菌液）培養(yǎng)后菌很多啊，但是挑了 ...

我覺得你還是把你的酶和載體換一套再試試，這個(gè)一般情況下很好做的，再不然就是你買的感受態(tài)有問題？我建議你還是自己花點(diǎn)時(shí)間自己制備點(diǎn)感受態(tài)。祝順利！

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56樓2013-03-30 09:46:02

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