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凌波麗

專家顧問 (知名作家)
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27樓: Originally posted by lmcyjxs at 2013-06-23 10:57:38
您好！謝謝您的耐心和熱心幫助！我對(duì)第一個(gè)解決路線不是很理解，是反轉(zhuǎn)錄后，用特異性上游引物和Oligo（dT）引物來做PCR擴(kuò)增，然后，將此RT-PCR產(chǎn)物克隆至克隆載體，測(cè)序初步表明是目的產(chǎn)物后再同時(shí)用特異性上游引 ...

“因?yàn)榉崔D(zhuǎn)錄的時(shí)候，已經(jīng)有同時(shí)用到Oligo（dT）和Ramdom 6 mers引物了，理論上Oligo（dT）引物可以將mRNA調(diào)取出來，即反轉(zhuǎn)錄液里就算有DNA的污染，應(yīng)該也會(huì)有cDNA存在而擴(kuò)到不含內(nèi)含子的CDS的，可是我的PCR產(chǎn)物里，只有含內(nèi)含子的目的基因，在相應(yīng)的位置上，不含內(nèi)含子的CDS產(chǎn)物連個(gè)影都沒有，我不是很理解�！�
我大致理解了你的話：你是說有內(nèi)含子的DNA有編碼區(qū)，沒有內(nèi)含子的DNA也同時(shí)沒有編碼區(qū)。
如果是這樣，可能有3個(gè)原因：
1.你的mRNA轉(zhuǎn)錄的隨機(jī)性太大，也就是因?yàn)橐D(zhuǎn)錄的DNA片段較長(zhǎng)，隨機(jī)引物6聚體的結(jié)合位點(diǎn)太多，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄本隨機(jī)性過多。
2.模板DNA存在污染。
3.Oligo（dT）引物引物太短，導(dǎo)致專業(yè)性不夠。
31樓2013-06-23 12:12:04
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凌波麗

專家顧問 (知名作家)
4.隨機(jī)引物的專一性不夠，可以換成基因特異性引物。隨機(jī)引物法的專一性較低，引物在整個(gè)轉(zhuǎn)錄本中的多個(gè)位點(diǎn)退火，產(chǎn)生短的和部分長(zhǎng)度的cDNA。基因特異性引物起始比隨機(jī)引物特異性高很多，Oligo（dT）引物其實(shí)介于兩者之間。
5.可能需要提高RT-PCR的專一性：分離出高質(zhì)量的mRNA；提高逆轉(zhuǎn)錄酶的保溫問題；添加促進(jìn)逆轉(zhuǎn)錄的添加劑:包括低于10%的甘油或者低于10%的DMSO；RT-PCR過程中加入RNase；設(shè)計(jì)高質(zhì)量的PCR引物。
32樓2013-06-23 12:27:35
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凌波麗

專家顧問 (知名作家)
回答27樓：
第六個(gè)原因：
6.mRNA是不是已經(jīng)斷裂或者降解了。

31樓到33樓都是回答樓主的27樓的問題。我是逐步想起來的各種可能的原因，所以分成幾貼回答。
33樓2013-06-23 12:32:57
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凌波麗

專家顧問 (知名作家)
引用回帖:
27樓: Originally posted by lmcyjxs at 2013-06-23 10:57:38
您好！謝謝您的耐心和熱心幫助！我對(duì)第一個(gè)解決路線不是很理解，是反轉(zhuǎn)錄后，用特異性上游引物和Oligo（dT）引物來做PCR擴(kuò)增，然后，將此RT-PCR產(chǎn)物克隆至克隆載體，測(cè)序初步表明是目的產(chǎn)物后再同時(shí)用特異性上游引 ...

“因?yàn)榉崔D(zhuǎn)錄的時(shí)候，已經(jīng)有同時(shí)用到Oligo（dT）和Ramdom 6 mers引物了，理論上Oligo（dT）引物可以將mRNA調(diào)取出來，即反轉(zhuǎn)錄液里就算有DNA的污染，應(yīng)該也會(huì)有cDNA存在而擴(kuò)到不含內(nèi)含子的CDS的，可是我的PCR產(chǎn)物里，只有含內(nèi)含子的目的基因，在相應(yīng)的位置上，不含內(nèi)含子的CDS產(chǎn)物連個(gè)影都沒有，我不是很理解�！�

在PCR產(chǎn)物里，只有含內(nèi)含子的目的基因，在相應(yīng)的位置上，不含內(nèi)含子的CDS產(chǎn)物連個(gè)影都沒有。歸納上面六條原因，具體為什么會(huì)有內(nèi)含子與編碼區(qū)偶聯(lián)的情況，可能是因?yàn)樵趃enomic DNA上的完全目的基因序列的5’和3’末端區(qū)可能有一些與6堿基隨機(jī)引物且很比較緊密的6堿基區(qū)，可能是含有較高的GC，在genomic DNA上的完全目的基因序列的對(duì)應(yīng)的mRNA的5’和3’末端區(qū)（5’-UTR和3’-UTR)可能不僅是有一些與6堿基隨機(jī)引物且很比較緊密的6堿基區(qū)，可能是含有較高的GC，而且在這些6堿基區(qū)的相鄰區(qū)域可能存在某些二級(jí)結(jié)構(gòu)而影響了隨機(jī)堿基6聚體引物在另外一些區(qū)域的隨機(jī)結(jié)合，或者促進(jìn)了5’-UTR和3’-UTR的結(jié)合隨機(jī)引物的效率。并且這種概率在PCR中得到了進(jìn)一步的放大。
另外也可能是在genomic DNA上的完全目的基因序列的對(duì)應(yīng)的mRNA的5’和3’末端區(qū)（5’-UTR和3’-UTR)的二級(jí)結(jié)構(gòu)和特異性的序列成為機(jī)械剪切力和RNase的作用位點(diǎn)的幾率較高。并且這種概率在PCR中得到了進(jìn)一步的放大。
所以引起genomic DNA上的完全目的基因序列的內(nèi)含子與編碼區(qū)偶全留或者全丟的概率比較大，并且在PCR中得到了至少第二次的進(jìn)一步的放大。

» 本帖已獲得的紅花（最新10朵）
34樓2013-06-23 13:59:56
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lmcyjxs

金蟲 (正式寫手)
引用回帖:
28樓: Originally posted by 凌波麗 at 2013-06-23 11:46:00
你的實(shí)驗(yàn)流程我沒有完全看懂�？赡苁且�?yàn)槲易鯬T-PCR較少，比如我不懂你的RT-PCR流程中為什么要水解DNA？

我先就你的你的這貼討論。在RT-PCR時(shí)，引物設(shè)計(jì)有3種方法即a：Random 9mers；b：Oligo(T)-Adaptor Prime ...

謝謝您的熱心解答！
思路決定出路。。。
35樓2013-06-23 14:17:22
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lmcyjxs

金蟲 (正式寫手)
引用回帖:
28樓: Originally posted by 凌波麗 at 2013-06-23 11:46:00
你的實(shí)驗(yàn)流程我沒有完全看懂�？赡苁且�?yàn)槲易鯬T-PCR較少，比如我不懂你的RT-PCR流程中為什么要水解DNA？

我先就你的你的這貼討論。在RT-PCR時(shí)，引物設(shè)計(jì)有3種方法即a：Random 9mers；b：Oligo(T)-Adaptor Prime ...

您好！看了您這么多回復(fù)，心存感激！謝謝！
    RT-PCR時(shí)，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA 的引物可以使用Random 6 mers、Oligo dT Primer 或特異性下游引物。3種引物適用范圍不同，特別是考慮到有些真核生物的mRNA不具有Poly（A）尾的問題，為使反轉(zhuǎn)錄完全，我RT時(shí)，將Random 6 mers、Oligo dT Primer同時(shí)使用了。
     然后用特異性引物和上述反轉(zhuǎn)錄液擴(kuò)增，得到的PCR產(chǎn)物，電泳結(jié)果與下圖的目的片段1相同，對(duì)PCR產(chǎn)物T-A克隆，測(cè)序結(jié)果比對(duì)表明，自己擴(kuò)了的是基因組序列。將內(nèi)含子去掉之后，與引物設(shè)計(jì)的原模板（完整CDS區(qū)）比對(duì)，相似度很高。足以再次說明，自己擴(kuò)的是含有內(nèi)含子的基因組序列。
大牛來指點(diǎn)下啊~CDS區(qū)到底含不含內(nèi)含子？看了相關(guān)的帖反而把我搞糊涂了
1.jpg
思路決定出路。。。
36樓2013-06-23 14:26:53
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lmcyjxs

金蟲 (正式寫手)
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29樓: Originally posted by 凌波麗 at 2013-06-23 11:54:45
“ 因?yàn)榉崔D(zhuǎn)錄的時(shí)候，已經(jīng)有同時(shí)用到Oligo（dT）和Ramdom 6 mers引物了，理論上Oligo（dT）引物可以將mRNA調(diào)取出來，即反轉(zhuǎn)錄液里就算有DNA的污染，應(yīng)該也會(huì)有cDNA存在而擴(kuò)到不含內(nèi)含子的CDS的，可是我的PCR產(chǎn)物里 ...

您分析的：“因?yàn)槟愕霓D(zhuǎn)錄本是沒有在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)過了轉(zhuǎn)錄后加工的，也就是說完全有可能存在內(nèi)含子序列。所以在反轉(zhuǎn)錄時(shí)要用沒有內(nèi)含子序列的DNA�！币虼宋姨崛NA，然后反轉(zhuǎn)錄后，再用自己的特異性引物來擴(kuò)增。
就因?yàn)槲疫@么做了，但糾結(jié)于為什么自己采用cDNA為模板，擴(kuò)出來的會(huì)是含內(nèi)含子的基因組序列，無法繼續(xù)做下面的蛋白表達(dá)實(shí)驗(yàn)。理論上，我采用了cDNA為模板，不該含內(nèi)含子，擴(kuò)出來的應(yīng)該是CDS全長(zhǎng)，電泳結(jié)果應(yīng)該如目的片段2。
大牛來指點(diǎn)下啊~CDS區(qū)到底含不含內(nèi)含子？看了相關(guān)的帖反而把我搞糊涂了-1
2.jpg
思路決定出路。。。
37樓2013-06-23 14:28:28
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lmcyjxs

金蟲 (正式寫手)
送紅花一朵
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34樓: Originally posted by 凌波麗 at 2013-06-23 13:59:56
“因?yàn)榉崔D(zhuǎn)錄的時(shí)候，已經(jīng)有同時(shí)用到Oligo（dT）和Ramdom 6 mers引物了，理論上Oligo（dT）引物可以將mRNA調(diào)取出來，即反轉(zhuǎn)錄液里就算有DNA的污染，應(yīng)該也會(huì)有cDNA存在而擴(kuò)到不含內(nèi)含子的CDS的，可是我的PCR產(chǎn)物里 ...

之前看到前面幾帖，我想到這樣：
1 隨機(jī)引物6聚體的結(jié)合位點(diǎn)太多，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄本隨機(jī)性過多
解決方法：反轉(zhuǎn)錄時(shí)，只加Oligo dT隨機(jī)引物，降低反轉(zhuǎn)錄的隨機(jī)性
2 模板DNA存在污染
解決方法：用DNAse I消化總RNA中的DNA或設(shè)計(jì)跨內(nèi)含子的引物
3 Oligo（dT）引物太短，導(dǎo)致專業(yè)性不夠及隨機(jī)引物的專一性不夠
解決方法：直接在反轉(zhuǎn)錄時(shí)就加自己的特異性引物。
4 “mRNA是不是已經(jīng)斷裂或者降解了”
mRNA極易降解，但因?yàn)樽约阂褦U(kuò)增得到該目的酶基因的基因組序列了，所以對(duì)于您分析的這點(diǎn)“mRNA是不是已經(jīng)斷裂或者降解了”，我覺得應(yīng)該不是主要原因。
5 提取高質(zhì)量RNA
     現(xiàn)在，看到這一帖，我覺得對(duì)我很有幫助，極有可能跟您說的一樣“genomic DNA上的完全目的基因序列的5’和3’末端區(qū)可能有一些與6堿基隨機(jī)引物且很比較緊密的6堿基區(qū)”，或許這會(huì)是我問題的根源之一。因?yàn)椋瑴y(cè)序結(jié)果表明，在5‘端還存在好像約有100bp的非編碼區(qū)，我會(huì)去嘗試一下這一點(diǎn)，即不用隨機(jī)堿基6聚體引物來做反轉(zhuǎn)錄，直接用Oligo dT或特異性引物來做，看看結(jié)果。
    您很用心，很有耐心，也很善分析，值得我學(xué)習(xí)！謝謝！
思路決定出路。。。
38樓2013-06-23 14:36:29
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凌波麗

專家顧問 (知名作家)
引用回帖:
37樓: Originally posted by lmcyjxs at 2013-06-23 14:28:28
您分析的：“因?yàn)槟愕霓D(zhuǎn)錄本是沒有在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)過了轉(zhuǎn)錄后加工的，也就是說完全有可能存在內(nèi)含子序列。所以在反轉(zhuǎn)錄時(shí)要用沒有內(nèi)含子序列的DNA�！币虼宋姨崛NA，然后反轉(zhuǎn)錄后，再用自己的特異性引物來擴(kuò)增。
就因 ...

我的建議是用基因特異性引引物啟動(dòng)RT-PCR；另外注意模板避免污染，如果使用了不含內(nèi)含子的模板仍有內(nèi)含子序列出現(xiàn)，那只能說明模板不純，被污染了，建議提純模板。
39樓2013-06-23 15:38:52
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凌波麗

專家顧問 (知名作家)
引用回帖:
38樓: Originally posted by lmcyjxs at 2013-06-23 14:36:29
之前看到前面幾帖，我想到這樣：
1 隨機(jī)引物6聚體的結(jié)合位點(diǎn)太多，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄本隨機(jī)性過多
解決方法：反轉(zhuǎn)錄時(shí)，只加Oligo dT隨機(jī)引物，降低反轉(zhuǎn)錄的隨機(jī)性
2 模板DNA存在污染
解決方法：用DNAse I消化總RNA中的 ...

做RT-PCR時(shí)，反轉(zhuǎn)錄所用的mRNA模板應(yīng)該分離提純。只用DNAse I消化總RNA中的DNA或設(shè)計(jì)跨內(nèi)含子的引物不可能完全去除長(zhǎng)鏈的DNA。

mRNA的分離方法較多，其中以寡聚（dT）-纖維素柱層析法最為有效，已成為常規(guī)方法。此法利用mRNA 3’末端含有Poly（A+）的特點(diǎn)，在RNA流經(jīng)寡聚（dT）纖維素柱時(shí)，在高鹽緩沖液的作用下，mRNA被特異地結(jié)合在柱上，當(dāng)逐漸降低鹽的濃度時(shí)或在低鹽溶液和蒸餾水的情況下，mRNA被洗脫，經(jīng)過兩次寡聚（dT）纖維柱后，即可得到較高純度的mRNA。
寡聚(dT)纖維素柱純化mRNA，proctocol舉例如下：
一、試劑準(zhǔn)備
1．3M醋酸鈉（pH 5.2）
2．0.1M NaOH
3．1×上樣緩沖液：20mM Tris-HCl(pH 7.6)；0.5M NaCl；1M EDTA（pH 8.0）；0.1%SLS(十二烷基氨酸鈉。配制時(shí)可先配制Tris-HCl(pH 7.6)、NaCl、EDTA（pH 8.0）的母液，經(jīng)高壓消毒后按各成分確切含量，經(jīng)混合后再高壓消毒，冷卻至65℃時(shí)，加入經(jīng)65℃溫育（30min）的10%SLS至終濃度為0.1%。
4．洗脫緩沖液：10mM Tris-HCl(pH 7.6)；1mM EDTA(pH 8.0)；0.05% SDS
5．無水乙醇、70%乙醇
6．DEPC
二、操作步驟
1．將0.5-1.0g寡聚（dT）-纖維懸浮于0.1M的NaOH溶液中。
2．用DEPC處理的1ml注射器或適當(dāng)?shù)奈�，將寡聚（dT）-纖維素裝柱0.5-1ml，用3倍柱床體積的DEPC H2O洗柱。
3．使用1×上樣緩沖液洗柱，直至洗出液pH值小于8.0。
4．將RNA溶解于DEPC H2O中，在65℃中溫育10min左右，冷卻至室溫后加入等體2×上樣緩沖液，混勻后上柱，立即收集流出液。當(dāng)RNA上樣液全部進(jìn)入柱床后，再用1×上樣緩沖液洗柱，繼續(xù)收集流出液。
5．將所有流出液于65℃加熱5min，冷卻至室溫后再次上柱，收集流出液。6．用5-10倍柱床體積的1×上樣緩沖液洗柱，每管1ml分部收集，OD260測(cè)定RNA含量。前部分收集管中流出液的OD260值很高，其內(nèi)含物為無Poly(A)尾的RNA。后部分收集管中流出液的OD260值很低或無吸收。
7．用2-3倍柱容積的洗脫緩沖液洗脫P(yáng)oly(A+)RNA，分部收集，每部分為1/3-1/2柱體積。
8．OD260測(cè)定Poly(A+)RNA分布，合并含Poly(A+)RNA的收集管，加入1/10體積3M NaAc（pH5.2）、2.5倍體積的預(yù)冷無水乙醇，混勻，-20℃放置30min。
9．4℃離心，10000g×15min，小心吸棄上清。用70%乙醇洗滌沉淀。[注意：此時(shí)Poly(A+)RNA的沉淀往往看不到]。4℃離心，10000g×5min，棄上清，室溫晾干。
10. 用適量的DEPC H2O溶解RNA。
三、注意事項(xiàng)1．整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程必須防止Rnase的污染。
2．步驟（4）中將RNA溶液置65℃中溫育然后冷卻至室溫再上樣的目的有兩個(gè)，一個(gè)是破壞RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，尤其是mRNA Poly(A+)尾處的二級(jí)結(jié)構(gòu)，使Poly(A+)尾充分暴露，從而提高Poly(A+)RNA的回收率；另一個(gè)目的是能解離mRNA與rRNA的結(jié)合，否則會(huì)導(dǎo)致rRNA的污染。所以此步驟不能省略。3．十二烷基肌氨酸鈉鹽在18℃以下溶解度下降，會(huì)阻礙柱內(nèi)液體流動(dòng)，若室溫低于18℃最好用LiCl替代NaCl。
4．寡聚（dT）-纖維素柱可在4℃貯存，反復(fù)使用。每次使用前應(yīng)該依次用NaOH、滅菌 ddH2O、上樣緩沖液洗柱。5．一般而言，107哺乳動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞能提取1-5μg Poly(A+)RNA，約相當(dāng)于上柱總RNA量的1%-2%。

此proctocols僅為舉例，不是唯一的試驗(yàn)流程，你可以查一下相關(guān)的實(shí)驗(yàn)手冊(cè)。
40樓2013-06-23 16:38:22
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