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lhs521521

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19樓: Originally posted by ljj0720 at 2013-07-05 21:27:58
還沒有

...

可以給我此基因的mRNA序列嗎，包括3‘UTR和5’UTR!

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21樓2013-07-06 08:49:16

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小飛8675

鐵蟲 (初入文壇)

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【答案】應(yīng)助回帖

★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
gyesang: 金幣+2, 熱心的蟲子！ 2013-07-07 17:51:41

http://www.med66.com/html/ziliao ... 7ec21b090eb5cbc.htm

這個(gè)鏈接告訴擴(kuò)增cDNA全長，并加上雙酶切位點(diǎn)，保護(hù)堿基，請(qǐng)看一下

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worthy is the lamb

22樓2013-07-06 15:15:15

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ljj0720

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引用回帖:

22樓: Originally posted by 小飛8675 at 2013-07-06 15:15:15
http://www.med66.com/html/ziliao/yixue/10/1f89a6014e659ecc77ec21b090eb5cbc.htm

這個(gè)鏈接告訴擴(kuò)增cDNA全長，并加上雙酶切位點(diǎn)，保護(hù)堿基，請(qǐng)看一下

謝謝那在這個(gè)鏈接里面你有沒有發(fā)現(xiàn)上游有一個(gè)堿基是對(duì)不上的
vpr基因：方向5’-----3‘
ATGGAACAATCCCCAGAAGATCAGGGGCCGCAGAGGGAACCACACAATGAATGGACACTA
GAGCTTCTAGAGGAGCTCAAGCAGGAAGCTGTCAGACACTTTCCTAGACCATGGCTTCAT
AGCTTAGGACAACATATCTATGACACATACGGGGATACTTGGGCAGGAGTGGAAGCCATA
ATAAGAACTCTGCAACAACTGCTGTTTATTCATTTCAGAATTGGGTGTCAGCATAGCAGA
ATAGGTATTTTGAGACAGAGAAGAACAAGAAATGGAGCCAGTAGATCCTAA

vpr-上游 5-CCCaagctt（保護(hù)堿基加酶切） ATGGAACAAGCCCCAGAAGA

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23樓2013-07-06 20:50:27

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ljj0720

銀蟲 (正式寫手)

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引用回帖:

21樓: Originally posted by lhs521521 at 2013-07-06 08:49:16
可以給我此基因的mRNA序列嗎，包括3‘UTR和5’UTR!...

謝謝我剛剛看見您的回復(fù)  我有DNA序列是原核生物
ORIGIN
      1 atgagtttta ggataaatac caatatcgcc gctttaactt ctcatgcggt aggggttcaa
   61 aacaacagag acctttcaag ctcgcttgaa aagttaagct cagggcttag gatcaataaa
   121 gccgctgacg attctagtgg gatggcgatc gctgatagct taaggagtca aagcgcgaat
   181 ttgggtcaag cgatccgcaa cgctaatgac gctattggta tggttcaaac cgcagataaa
   241 gcgatggatg agcaaatcaa aatcttagac accattaaaa ccaaagccgt tcaagccgct
   301 caagacgggc aaactttaga aagccgaaga gccctccaga gcgatattca aaggttgtta
   361 gaagaactag acaatatcgc taacaccaca agctttaacg gccaacaaat gctttcagga
   421 agtttttcta acaaagaatt tcaaattggc gcgtattcta acaccacggt taaggcgtct
   481 attggctcaa cgagctcaga taagattggg catgtgcgca tggaaacttc ttcttttagc
   541 ggtgcaggca tgctcgctag cgcagcggcg caaaacttga ctgaagtggg attgaatttc
   601 aaacaagtca atggcgtgaa cgattataag attgaaaccg tgcgcatttc tacgagtgct
   661 ggcactggga ttggagcgtt aagcgaaatc atcaaccgct tttctaacac cttaggcgtt
   721 agggcctctt ataatgtcat ggccaccggt ggcactcccg tgcaatcagg aactgttagg
   781 gagctcacca ttaatggcgt agaaattggg accgtgaatg atgtgcataa aaacgacgct
   841 gacgggaggt tgactaacgc cattaactcc gtcaaagatc gcaccggcgt ggaagcgagc
   901 ttggatattc aagggcgcat taatttgcac tccattgacg ggcgcgcgat ttctgtgcat
   961 gcagcgagcg cgagcggtca ggtttttggg ggagggaatt ttgcagggat ttctgggaca
   1021 cagcatgcgg ttattgggcg cttaaccttg actaggaccg acgctagaga catcattgta
   1081 agcggtgtga attttagcca tgtgggcttt cattccgctc aaggggtggc agaatacacc
   1141 gtgaatttga gagcggttag gggtattttt gatgcgaatg tggcttcagc agccggagcg
   1201 aacgctaatg gcgcgcaagc ggagaccaat tctcaaggta taggggctgg ggtaacaagc
   1261 cttaaagggg cgatgattgt gatggatatg gcggattcag cgcgcacgca attagacaag
   1321 atccgctcgg atatgggttc ggtgcaaatg gaattggtta caaccattaa taatatttct
   1381 gtaacccaag tgaatgttaa agcggctgaa tctcaaatca gagatgtgga ttttgctgaa
   1441 gagagcgcaa acttttctaa atacaatatt ttggcgcaaa gcgggagttt tgctatggcg
   1501 caagcgaatg cggtgcaaca aaatgtctta aggcttttac aataa

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24樓2013-07-06 20:54:04

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zhouking8758

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★ ★
gyesang: 金幣+2, 感謝應(yīng)助！ 2013-07-07 17:52:16

設(shè)計(jì)個(gè)引物都這么糾結(jié)。
對(duì)于樓主這種擴(kuò)增基因全長的情況，一般只能從起始密碼子開始設(shè)計(jì)上游引物，從終止密碼子設(shè)計(jì)下游引物，而且必須要借助軟件來評(píng)價(jià)引物之間的二級(jí)結(jié)構(gòu)、引物二聚體和錯(cuò)配情況，尤其要注意錯(cuò)配率不要太高。當(dāng)然，錯(cuò)配、二聚體、二級(jí)結(jié)構(gòu)等是不可能都完全消除防護(hù)，但是可以通過改變上下游引物長度來盡可能的是的他們的自由能絕對(duì)值最小化。
設(shè)計(jì)引物的時(shí)候考慮好是否要加入tag和酶切位點(diǎn)，同時(shí)要注意不要移碼。
建議樓主google一下，引物的設(shè)計(jì)相關(guān)資料。

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25樓2013-07-07 00:11:59

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lhs521521

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引用回帖:

24樓: Originally posted by ljj0720 at 2013-07-06 20:54:04
謝謝我剛剛看見您的回復(fù)  我有DNA序列是原核生物
ORIGIN
      1 atgagtttta ggataaatac caatatcgcc gctttaactt ctcatgcggt aggggttcaa
   61 aacaacagag acctttcaag ctcgcttgaa aagttaagct cagg ...

ATG上游和TAA下游的序列還有嗎？最好全給我！

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26樓2013-07-07 08:01:22

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小love肖

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【答案】應(yīng)助回帖

GCCGCCACC是kozak序列，我們一直用這個(gè)，后面接ATG，對(duì)于PCR擴(kuò)增是極好的

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27樓2013-07-08 08:41:56

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ljj0720

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引用回帖:

26樓: Originally posted by lhs521521 at 2013-07-07 08:01:22
ATG上游和TAA下游的序列還有嗎？最好全給我！...

嗯剛剛看見  謝謝
ORIGIN
      1 tttatccaaa aaatttttaa ttgttttggc ttttgcgggg gattctacga taataaggtg
   61 cttcattgaa cgcctttaat aaaatgttta tacctattaa tgaatgattg tagcatagaa
   121 ttttgactaa acgattcatt aaaccataaa aactataacg gcgctaaaaa tcaaagagtt
   181 ggaacaccct ttgcttgact aacagcaaat atctatgcaa aggatgcaaa catgagtttt
   241 aggataaata ccaatatcgc cgctttaact tctcatgcgg taggggttca aaacaacaga
   301 gacctttcaa gctcgcttga aaagttaagc tcagggctta ggatcaataa agccgctgac
   361 gattctagtg ggatggcgat cgctgatagc ttaaggagtc aaagcgcgaa tttgggtcaa
   421 gcgatccgca acgctaatga cgctattggt atggttcaaa ccgcagataa agcgatggat
   481 gagcaaatca aaatcttaga caccattaaa accaaagccg ttcaagccgc tcaagacggg
   541 caaactttag aaagccgaag agccctccag agcgatattc aaaggttgtt agaagaacta
   601 gacaatatcg ctaacaccac aagctttaac ggccaacaaa tgctttcagg aagtttttct
   661 aacaaagaat ttcaaattgg cgcgtattct aacaccacgg ttaaggcgtc tattggctca
   721 acgagctcag ataagattgg gcatgtgcgc atggaaactt cttcttttag cggtgcaggc
   781 atgctcgcta gcgcagcggc gcaaaacttg actgaagtgg gattgaattt caaacaagtc
   841 aatggcgtga acgattataa gattgaaacc gtgcgcattt ctacgagtgc tggcactggg
   901 attggagcgt taagcgaaat catcaaccgc ttttctaaca ccttaggcgt tagggcctct
   961 tataatgtca tggccaccgg tggcactccc gtgcaatcag gaactgttag ggagctcacc
   1021 attaatggcg tagaaattgg gaccgtgaat gatgtgcata aaaacgacgc tgacgggagg
   1081 ttgactaacg ccattaactc cgtcaaagat cgcaccggcg tggaagcgag cttggatatt
   1141 caagggcgca ttaatttgca ctccattgac gggcgcgcga tttctgtgca tgcagcgagc
   1201 gcgagcggtc aggtttttgg gggagggaat tttgcaggga tttctgggac acagcatgcg
   1261 gttattgggc gcttaacctt gactaggacc gacgctagag acatcattgt aagcggtgtg
   1321 aattttagcc atgtgggctt tcattccgct caaggggtgg cagaatacac cgtgaatttg
   1381 agagcggtta ggggtatttt tgatgcgaat gtggcttcag cagccggagc gaacgctaat
   1441 ggcgcgcaag cggagaccaa ttctcaaggt ataggggctg gggtaacaag ccttaaaggg
   1501 gcgatgattg tgatggatat ggcggattca gcgcgcacgc aattagacaa gatccgctcg
   1561 gatatgggtt cggtgcaaat ggaattggtt acaaccatta ataatatttc tgtaacccaa
   1621 gtgaatgtta aagcggctga atctcaaatc agagatgtgg attttgctga agagagcgca
   1681 aacttttcta aatacaatat tttggcgcaa agcgggagtt ttgctatggc gcaagcgaat
   1741 gcggtgcaac aaaatgtctt aaggctttta caataacagc ccttttaatt caaaggggcg
   1801 ttagcccttt ttataagtta gaacgatgga tatttatcaa aaaaacttgc aagctctttt
   1861 caaaaaagac cctcttttgt tcgcaaagct caaagccatt aaagaaaaca aaaaatacga
   1921 agtgttttta gggaatgata gcgcgaattt caacctctta gataaagaaa caaacacgcc
   1981 cttatttgaa aaaagcccgc tagattcaa
這是原基因謝謝您

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28樓2013-07-08 15:57:52

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F: ATCAAAGAGTTGGAACACCCTT 22bp TM: 59
R: GCTATCATTCCCTAAAAACACT 22bp TM: 54.5
product length: 1773bp

上游和下游加上你要連接到載體上的酶切位點(diǎn)！
我也不知道擴(kuò)增效果如何，僅供參考！

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29樓2013-07-08 18:08:10

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29樓: Originally posted by lhs521521 at 2013-07-08 18:08:10
F: ATCAAAGAGTTGGAACACCCTT 22bp TM: 59
R: GCTATCATTCCCTAAAAACACT 22bp TM: 54.5
product length: 1773bp

上游和下游加上你要連接到載體上的酶切位點(diǎn)！
我也不知道擴(kuò)增效果如何，僅供參考！

大俠這樣做我只有一個(gè)問題解決不了 product length: 1773bp
擴(kuò)增產(chǎn)物已經(jīng)不是原來我的基因全長了那樣行嗎我P樣的目的就是為了擴(kuò)增我的基因全長這樣不就是已經(jīng)變了嗎？

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30樓2013-07-09 07:12:26

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