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JAYWEN書(shū)生

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10樓: Originally posted by 愛(ài)上文慧 at 2013-09-05 15:05:51
一種可能是你pcr試劑被污染了，
另一種就是你提rna，沒(méi)有提出來(lái)，你是用的試劑盒嗎？

是試劑盒，不是RNA，提的質(zhì)粒。今天下午換了水，沒(méi)有P出條帶，連接在T載體上的目的基因能P出條帶，就是酶切連接到表達(dá)載體上時(shí)就沒(méi)條帶了

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11樓2013-09-05 18:14:40

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Jaaar

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【答案】應(yīng)助回帖

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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
gyesang: 金幣+1, 鼓勵(lì)回帖交流！ 2013-09-06 11:48:38

引用回帖:

11樓: Originally posted by JAYWEN書(shū)生 at 2013-09-05 18:14:40
是試劑盒，不是RNA，提的質(zhì)粒。今天下午換了水，沒(méi)有P出條帶，連接在T載體上的目的基因能P出條帶，就是酶切連接到表達(dá)載體上時(shí)就沒(méi)條帶了...

根據(jù)你之前的描述應(yīng)該是存在PCR體系污染，最有可能的應(yīng)該是在引物。

那么假設(shè)引物的污染不影響結(jié)果，那么還是有以下的問(wèn)題需要解決的

酶切之后有跑膠確認(rèn)pET載體以及帶目的基因的T載體都完全反應(yīng)了么？

還有就是連接的時(shí)候目的片段和載體之間的比例是否恰當(dāng)？

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12樓2013-09-06 11:09:48

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引用回帖:

12樓: Originally posted by Jaaar at 2013-09-06 11:09:48
根據(jù)你之前的描述應(yīng)該是存在PCR體系污染，最有可能的應(yīng)該是在引物。

那么假設(shè)引物的污染不影響結(jié)果，那么還是有以下的問(wèn)題需要解決的

酶切之后有跑膠確認(rèn)pET載體以及帶目的基因的T載體都完全反應(yīng)了么？

...

酶切之后跑膠回收，回收完了，又跑膠做了驗(yàn)證，有目的基因和PET的條帶，但是連接之后做轉(zhuǎn)化，再提質(zhì)粒PCR就沒(méi)有了，剛才重新做的酶切，又是到提質(zhì)粒PCR沒(méi)有目的基因條帶了，但是質(zhì)粒PCR的泳道上有好多雜條帶，這是為啥呢？

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13樓2013-09-06 13:48:19

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【答案】應(yīng)助回帖

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看了你的描述，除了他們說(shuō)的，我覺(jué)得還有一種可能是長(zhǎng)得單菌落根本不是大腸桿菌，可能是雜菌，你挑了雜菌搖后PCR有雜帶，提質(zhì)粒更是提不出來(lái)。也就是說(shuō)很可能你連接失敗了。ps：你的單菌落從涂板到長(zhǎng)出來(lái)用了多長(zhǎng)時(shí)間？

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生如夏花，在追求絢爛的結(jié)果的同時(shí)，別忘了享受過(guò)程的美好！

14樓2013-09-06 17:21:16

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再ps：根據(jù)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，菌液PCR不靠譜，有的實(shí)際連上了也p不出來(lái)，沒(méi)連上的也可能出現(xiàn)所謂的“目的”條帶，所以連接后一定要酶切和測(cè)序，提質(zhì)粒也不難，我還是覺(jué)得你挑的單菌落是雜菌的可能性大

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15樓2013-09-06 17:26:45

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14樓: Originally posted by ivan94 at 2013-09-06 17:21:16
看了你的描述，除了他們說(shuō)的，我覺(jué)得還有一種可能是長(zhǎng)得單菌落根本不是大腸桿菌，可能是雜菌，你挑了雜菌搖后PCR有雜帶，提質(zhì)粒更是提不出來(lái)。也就是說(shuō)很可能你連接失敗了。ps：你的單菌落從涂板到長(zhǎng)出來(lái)用了多長(zhǎng)時(shí) ...

涂板后過(guò)夜就能長(zhǎng)出來(lái)，菌液PCR后只有一條跟目的基因大小一樣的帶，就是在提質(zhì)粒后PCR沒(méi)有目的條帶，有雜帶。。然后再對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，沒(méi)有目的基因…………

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16樓2013-09-06 19:28:21

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16樓: Originally posted by JAYWEN書(shū)生 at 2013-09-06 19:28:21
涂板后過(guò)夜就能長(zhǎng)出來(lái)，菌液PCR后只有一條跟目的基因大小一樣的帶，就是在提質(zhì)粒后PCR沒(méi)有目的條帶，有雜帶。。然后再對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，沒(méi)有目的基因…………...

那就很可能你挑的是雜菌的點(diǎn)，剛好跟你目的基因大小差不多，不能說(shuō)大小一樣，因?yàn)?個(gè)marker條帶之間也看不出精確的大小。從頭重新連吧！

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17樓2013-09-06 20:19:16

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你菌液pcr用的是目的片段的引物么？還是載體的？

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18樓2013-09-07 11:01:49

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18樓: Originally posted by 莓林塔 at 2013-09-07 11:01:49
你菌液pcr用的是目的片段的引物么？還是載體的？

目的片段的！

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19樓2013-09-08 14:13:45

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17樓: Originally posted by ivan94 at 2013-09-06 20:19:16
那就很可能你挑的是雜菌的點(diǎn)，剛好跟你目的基因大小差不多，不能說(shuō)大小一樣，因?yàn)?個(gè)marker條帶之間也看不出精確的大小。從頭重新連吧！...

恩，好的，謝了啊

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20樓2013-09-08 14:14:31

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