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崔永霞

鐵蟲 (小有名氣)

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10樓: Originally posted by lmcyjxs at 2013-09-22 21:19:07
樓主說酶含有內(nèi)含子？？你是想說你要擴(kuò)的基因含有內(nèi)含子吧？假如你要擴(kuò)的序列是已知的，即有完整的CDS區(qū)，那么，引物很好設(shè)計(jì)，直接CDS區(qū)兩端寫應(yīng)該都可以擴(kuò)出來的，如果你的是未知的，那么你就要做RACE，如樓上有朋 ...

首先非常感謝，我有這個(gè)酶的完整的cDNA序列，我在這個(gè)CDNA序列的兩端設(shè)計(jì)過引物，可是擴(kuò)不出來，我也不知道是什么原因，我想是不是因?yàn)槲以O(shè)計(jì)的引物有可能在以基因組為模板的時(shí)候被內(nèi)含子隔斷了呢？我的酶是植物中的一個(gè)酶。

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11樓2013-09-23 10:58:56

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守望者047

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gyesang: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流！ 2013-09-28 20:40:02

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9樓: Originally posted by 崔永霞 at 2013-09-22 14:30:10
需要設(shè)計(jì)很多對(duì)引物是什么意思��？...

做race需要一段一段的PCR，直到把基因的全序列都p出來，當(dāng)然要設(shè)計(jì)很多對(duì)引物，而且需要很長(zhǎng)的時(shí)間才能完成，祝你好運(yùn)

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12樓2013-09-24 11:11:54

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崔永霞

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5樓: Originally posted by laojiu9878 at 2013-09-22 09:45:41
做簡(jiǎn)并引物，還是已經(jīng)有序列直接擴(kuò)；不同的注意點(diǎn)不同，要多考慮，或者查文獻(xiàn)看別人是否設(shè)計(jì)過

1 只有一個(gè)完整的cdna編碼序列，順便說一下，這個(gè)植物的基因組到現(xiàn)在還沒有測(cè)出來。
2 我是要以DNA 為模板設(shè)計(jì)引物，所以引物不好設(shè)計(jì)��！

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13樓2013-09-25 20:37:31

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我是在CDS的兩端設(shè)計(jì)的上下游引物啊，分別跨過了起始密碼子和終止密碼子，可是還是擴(kuò)不出來啊？我也不不知道原因是什么？我是以DNA為模板的，是不是不應(yīng)該是以DNA為模板��？應(yīng)該是提RNA，然后反轉(zhuǎn)錄，再然后以CNA為模板擴(kuò)增 ��？
謝謝啦？

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14樓2013-09-25 20:42:42

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★ ★
崔永霞: 金幣+1, ★有幫助 2013-09-27 12:41:12
gyesang: 金幣+1, 鼓勵(lì)回帖交流！ 2013-09-28 20:40:13

引用回帖:

14樓: Originally posted by 崔永霞 at 2013-09-25 20:42:42
我是在CDS的兩端設(shè)計(jì)的上下游引物啊，分別跨過了起始密碼子和終止密碼子，可是還是擴(kuò)不出來�。课乙膊徊恢涝蚴鞘裁�？我是以DNA為模板的，是不是不應(yīng)該是以DNA為模板啊？應(yīng)該是提RNA，然后反轉(zhuǎn)錄，再然后以CNA為 ...

可以以DNA為模板，你的擴(kuò)增體系及程序有無問題呢？你的退火溫度各方面是否合適？你懷疑引物有問題，那好辦，交給生工或其他一些公司，讓專業(yè)的人幫你設(shè)計(jì)，免費(fèi)的。

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15樓2013-09-26 17:07:52

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15樓: Originally posted by lmcyjxs at 2013-09-26 17:07:52
可以以DNA為模板，你的擴(kuò)增體系及程序有無問題呢？你的退火溫度各方面是否合適？你懷疑引物有問題，那好辦，交給生工或其他一些公司，讓專業(yè)的人幫你設(shè)計(jì)，免費(fèi)的。...

那以DNA 為模板的話，我設(shè)計(jì)的引物是不是很有可能被內(nèi)含子隔斷啊，我做的這個(gè)酶是植物中的，而且這種植物的基因組到現(xiàn)在還沒有公布？

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16樓2013-09-27 12:41:05

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崔永霞: 金幣+1, ★有幫助, 非常感謝！ 2013-09-28 11:42:12

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16樓: Originally posted by 崔永霞 at 2013-09-27 12:41:05
那以DNA 為模板的話，我設(shè)計(jì)的引物是不是很有可能被內(nèi)含子隔斷啊，我做的這個(gè)酶是植物中的，而且這種植物的基因組到現(xiàn)在還沒有公布？...

有可能，那你就提RNA再反轉(zhuǎn)錄PCR，注意要消化掉DNA。

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17樓2013-09-27 14:06:43

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引物設(shè)計(jì)是很重要，但是你也要看看你的引物和pcr其他組分是不是有問題。還應(yīng)該在pcr條件上做調(diào)節(jié)。梯度溫度試試沒有？你是用什么軟件設(shè)計(jì)的？

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18樓2013-09-27 14:50:18

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18樓: Originally posted by 沙門小rna at 2013-09-27 14:50:18
引物設(shè)計(jì)是很重要，但是你也要看看你的引物和pcr其他組分是不是有問題。還應(yīng)該在pcr條件上做調(diào)節(jié)。梯度溫度試試沒有？你是用什么軟件設(shè)計(jì)的？

梯度溫度也試過了，我是用primer5設(shè)計(jì)的。

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19樓2013-09-28 11:43:36

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19樓: Originally posted by 崔永霞 at 2013-09-28 11:43:36
梯度溫度也試過了，我是用primer5設(shè)計(jì)的。...

不會(huì)吧？多長(zhǎng)的片段��？用的酶和其他東西check了嗎？延伸時(shí)間，循環(huán)數(shù)呢？

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20樓2013-10-11 21:57:47

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