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sun_in_night

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gyesang: 金幣+2, 鼓勵交流！ 2013-11-09 01:35:09

如果你不確定是不是酶切問題，那你可以放一個對照。兩個處理：（1）酶切的質(zhì)粒+酶切片段（2）酶切的質(zhì)粒不加目的片段。將兩個都轉化。如果你連酶切的質(zhì)粒，不加插入片段的轉化都有菌斑，那說明酶切是沒成功。

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11樓2013-11-08 23:43:52

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引用回帖:

11樓: Originally posted by sun_in_night at 2013-11-08 23:43:52
如果你不確定是不是酶切問題，那你可以放一個對照。兩個處理：（1）酶切的質(zhì)粒+酶切片段（2）酶切的質(zhì)粒不加目的片段。將兩個都轉化。如果你連酶切的質(zhì)粒，不加插入片段的轉化都有菌斑，那說明酶切是沒成功。

可是我的酶切的質(zhì)粒加目的片段連接轉化都沒有菌落啊，那是不是說明質(zhì)粒已經(jīng)切開了，沒有自連。
我在想會不會是我切的太狠了把粘性末端切壞了，請問這個有可能不？

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12樓2013-11-09 19:54:38

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【答案】應助回帖

感謝參與，應助指數(shù) +1

引用回帖:

9樓: Originally posted by windleakey at 2013-11-08 21:40:31
恩，我的雙酶切都是37度。10到15分鐘這么短可以嗎？我一般都3個小時呢？
槍吹打幾次算劇烈不？我都會吹大混勻的。...

有些是用快酶酶切的，所以時間很短，Takara、Fermentas都有生產(chǎn)快酶。若用普通Takara 限制酶的話，按照說明書是一個小時，當然可以延長，畢竟酶在運輸過程中可能出現(xiàn)一些問題。后面你再看下選用的兩種酶緩沖液是否合適或檢查下會不會出現(xiàn)同步酶切效果差這方面的問題。

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13樓2013-11-10 08:40:44

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bloodwar

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【答案】應助回帖

感謝參與，應助指數(shù) +1

我用于鏈接的雙酶切都是過夜的，你要不把插入片段的量增加點試試，要不就是載體出問題了

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14樓2013-11-10 09:48:45

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sun_in_night

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引用回帖:

12樓: Originally posted by windleakey at 2013-11-09 06:54:38
可是我的酶切的質(zhì)粒加目的片段連接轉化都沒有菌落啊，那是不是說明質(zhì)粒已經(jīng)切開了，沒有自連。
我在想會不會是我切的太狠了把粘性末端切壞了，請問這個有可能不？...

那你可以縮短一下時間，但我覺得這不是主要問題，3小時不長。
你再反復確認一下你的PCR產(chǎn)物的酶切位點和質(zhì)粒上的是否一樣。再者你可以拿個其他的已經(jīng)連上的gene的載體用相同的酶切一下，然后連到你要的載體上。這樣你就可以確認是不是你的酶切、連接體系有問題了。如果上面的可以，那很有可能是你的PCR產(chǎn)物的酶切出了問題。

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windleakey

15樓2013-11-10 11:53:07

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windleakey

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13樓: Originally posted by yujitianqing at 2013-11-10 08:40:44
有些是用快酶酶切的，所以時間很短，Takara、Fermentas都有生產(chǎn)快酶。若用普通Takara 限制酶的話，按照說明書是一個小時，當然可以延長，畢竟酶在運輸過程中可能出現(xiàn)一些問題。后面你再看下選用的兩種酶緩沖液是否 ...

恩，謝謝建議，我再重新檢查一下

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16樓2013-11-12 21:29:02

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15樓: Originally posted by sun_in_night at 2013-11-10 11:53:07
那你可以縮短一下時間，但我覺得這不是主要問題，3小時不長。
你再反復確認一下你的PCR產(chǎn)物的酶切位點和質(zhì)粒上的是否一樣。再者你可以拿個其他的已經(jīng)連上的gene的載體用相同的酶切一下，然后連到你要的載體上。這 ...

恩，謝謝，我按照你說的試一試

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17樓2013-11-12 21:30:02

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xipha

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【答案】應助回帖

看電泳亮度應該是很準的。除了酶切問題，抗生素也有可能，如果樓主用的是氨芐，建議加大濃度。對照質(zhì)粒建議使用實驗室已經(jīng)成功的同類基因，試劑盒提供的質(zhì)粒太牛了，一般沒有很大參考價值，可以的話建議用另一端有人做過的基因酶切鏈接轉化看看。

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18樓2013-11-13 02:11:04

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【答案】應助回帖

轉化沒有長菌落，這基本可以說明酶切是沒有問題的，說明質(zhì)粒被切開了，我覺得你在看亮度的時候沒有考慮片段長度。一般來說，相同濃度的DNA，片段越長越亮，假如說有兩段長度相同的DNA：a和b，a的亮度是b的5倍，那么可以認為a的濃度也是b的5倍；如果他們的濃度一樣的話，同樣可以認為a的長度是b的5倍。反推回去也是一樣的�？傊�，亮度是由長度和濃度共同決定的。

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我給不了你寶馬香車，錦衣玉食，但我會用一輩子去疼你，愛你，保護你

19樓2013-11-13 10:37:28

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【答案】應助回帖

你可以先轉化大腸桿菌做個模式反應看看，只要轉化的大腸桿菌有轉化子那就是鏈接成功了，是你的轉化出了問題，還有就是請你說明是轉的什么宿主，大致條件是什么。。這樣好判斷些

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20樓2013-11-13 10:47:02

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