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XOooZzz

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【答案】應(yīng)助回帖

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楊玉煥123: 金幣+16, ★有幫助 2014-03-04 10:36:24

引用回帖:

20樓: Originally posted by 楊玉煥123 at 2014-03-04 09:42:00
不好意思，再打擾一下，你寫的第二步中用的是氯仿？不是酚仿？還有用75%乙醇洗滌時(shí)，體積大概是多少呢？謝謝哈...

哦，寫錯(cuò)了，是氯仿異戊醇。沒(méi)用過(guò)酚。
我在200 uL PCR管里操作，加幾十到100 uL乙醇吧。PCR管套到0.5 mL離心管再套到1.5 mL離心管里再去離心。

你這是要做載體單酶切去磷酸化嗎？有些限制酶的buffer和CIP是兼容的，譬如Thermo的fast digest。我是用Thermo的快酶，20uL 體系37度酶切反應(yīng)半小時(shí)后，直接加Takara的cip 0.5～1 uL，繼續(xù)37度反應(yīng)1小時(shí)，高溫失活，跑膠回收。這樣就省下一個(gè)回收步驟了。

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21樓2014-03-04 10:22:52

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楊玉煥123

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引用回帖:

21樓: Originally posted by XOooZzz at 2014-03-03 14:22:52
哦，寫錯(cuò)了，是氯仿異戊醇。沒(méi)用過(guò)酚。
我在200 uL PCR管里操作，加幾十到100 uL乙醇吧。PCR管套到0.5 mL離心管再套到1.5 mL離心管里再去離心。

你這是要做載體單酶切去磷酸化嗎？有些限制酶的buffer和CIP是兼 ...

嗯，我用的是寶生物的BamH 1單酶切，載體是pet28a，酶切4-6h，酶切后有時(shí)還有環(huán)狀的，所以都是切膠回收，然后用Takara的CIAP去磷酸化，再與酶切后的DNA連接、轉(zhuǎn)化，謝謝你哈

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22樓2014-03-04 10:36:26