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shiyiyaya金蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
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[求助]
克隆失敗原因：NdeI+KpnI？ 已有4人參與
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現(xiàn)有: 15K質(zhì)粒pA，NdeI+KpnI雙酶切之后產(chǎn)生11K+4K（回收11K做載體）； 6.7K質(zhì)粒pB，NdeI+KpnI雙酶切之后產(chǎn)生4K+2.7K（回收4K做外源DNA）; 連接回收的11K和4K。 結(jié)果失敗：經(jīng)多種方案鑒定，轉(zhuǎn)化長(zhǎng)出來(lái)的重組子都是質(zhì)粒pB. 我已經(jīng)嘗試單酶切*2次、PCR擴(kuò)增4K片段，重新轉(zhuǎn)化質(zhì)粒，挑單克隆再繼續(xù)…都不行。感覺(jué)就像pB沒(méi)有切干凈。 請(qǐng)問(wèn)蟲(chóng)友，可否遇到類(lèi)似情況？NdeI+KpnI，這兩個(gè)酶的活性就是低嗎？ 謝謝幫忙！ |
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atlanticwi
金蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
琴美喜歡發(fā)呆 不喜歡發(fā)脾氣
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西門(mén)吹雪170: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-03-06 12:38:32
西門(mén)吹雪170: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-03-06 12:38:32
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............. 首先，酶自身不會(huì)有問(wèn)題，其次，我不明白的是這個(gè)問(wèn)題，你PCR 4K片段，再做連接，會(huì)不會(huì)長(zhǎng)出來(lái)的也是pB質(zhì)粒？如果是，污染是可能性很大，我估計(jì)那個(gè)7k左右的質(zhì)粒其實(shí)并不是pB。我以前遇到這種情況，雙酶切載體（載體上帶片段，所以雙酶切可以分辨清楚），用了一個(gè)不加片段而加ddH2O的對(duì)照，發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)出來(lái)的很多克隆，這些克隆用一個(gè)酶酶切是原來(lái)載體的樣子，用另一個(gè)酶酶切就不對(duì)了。所以我懷疑污染的可能性要大于載體自連的可能性。 所以針對(duì)你的情況，我的建議是這樣，把4K的片段克隆到T載體上，然后用T載體上酶切下來(lái)的片段和11K做連接。繞過(guò)對(duì)pB質(zhì)粒進(jìn)行的直接操作。另一個(gè)，做構(gòu)建盡量選用硅膠柱做質(zhì)粒提取是比較合適的。 |
8樓2014-03-06 06:21:13
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
gyesang: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流！ 2014-03-05 22:48:14
shiyiyaya: 金幣+2, ★有幫助 2014-03-05 23:02:49
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shiyiyaya: 金幣+2, ★有幫助 2014-03-06 20:28:28
| 酶切的話，不存在那種酶的酶活性問(wèn)題，有的只是不同廠家的酶質(zhì)量問(wèn)題，另外存放等影響因素。當(dāng)然操作時(shí)添加適當(dāng)?shù)牧恳彩窍喈?dāng)重要的。我覺(jué)得你說(shuō)說(shuō)你的酶切和連接具體操作會(huì)有助于大家對(duì)你進(jìn)行分析。 |
2樓2014-03-05 20:19:38
lvbobo823
鐵桿木蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
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【答案】應(yīng)助回帖
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shiyiyaya: 金幣+2, ★有幫助 2014-03-05 22:53:18
| 建議你換換新酶分別酶切，每次酶切跑個(gè)膠看看有沒(méi)有切完全，轉(zhuǎn)化時(shí)加一個(gè)酶切對(duì)照看看有沒(méi)有菌生長(zhǎng)，沒(méi)長(zhǎng)說(shuō)明切完全，長(zhǎng)了但比連接產(chǎn)物少很多表明還可以挑選出陽(yáng)性菌。 |
3樓2014-03-05 20:54:57
shiyiyaya
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4樓2014-03-05 22:53:08
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