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10樓: Originally posted by 1296785943 at 2014-03-28 10:45:45
我換了Rosetta的感受態(tài)，18度誘導(dǎo)表達(dá)了。還沒來(lái)得及分析是不是在包涵體表達(dá)。請(qǐng)問如果在包涵體表達(dá)，你們是怎么做純化的呢？純化效果怎么樣？謝謝�。�！...

我們目的基因前面有6XHis標(biāo)簽，將包涵體復(fù)性透析，然后用Ni-NTA親和層析，用咪唑洗

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回復(fù)此樓

11樓2014-03-28 15:45:27

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woolley

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【答案】應(yīng)助回帖

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1296785943(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+3, 鼓勵(lì)熱心回帖交流 2014-03-29 21:33:25

你的重組質(zhì)粒的讀碼框沒有問題。
如果再遇到這樣的問題，你還可以關(guān)注一下起始密碼子前面的RBS等區(qū)域，看看有沒有問題，點(diǎn)背的話那些個(gè)位置突變，也是沒有表達(dá)的。
你現(xiàn)在18度有了表達(dá)，應(yīng)該就不是上述問題了。
你之前用pET17b，現(xiàn)在改用pET28+SUMO，而且表達(dá)的時(shí)候直接測(cè)試了18度，我猜你pET17b應(yīng)該是包涵體了。SUMO融合會(huì)有一定的促溶解作用，可能會(huì)在胞質(zhì)。
如果不幸還在包涵體里，由于你的蛋白帶Histag純化起來(lái)倒是很簡(jiǎn)單，離心收菌，破碎，棄上清，8M尿素溶解包涵體，然后Ni柱純化(可以選擇咪唑梯度洗脫，也可以算則pH梯度洗脫)，在變性條件下，pH梯度有時(shí)要比咪唑梯度純化的干凈一些。
之后的問題就來(lái)了，如果你需要復(fù)性，那么將是一個(gè)很復(fù)雜而且成功率很低的過(guò)程，除非有類似蛋白的復(fù)性成功文獻(xiàn)做參考。
還有就是，你的SUMO同目標(biāo)蛋白(好象是RTS?)連接位置的氨基酸是QINGSM(你ORF finder圖片417位置附近)，由于氨基酸是NG不是GG，所以可能切不下來(lái)……

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回復(fù)此樓

12樓2014-03-28 19:08:22

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