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北京石油化工學(xué)院2026年研究生招生接收調(diào)劑公告

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meng_xu

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15樓: Originally posted by 成功源于想像 at 2014-05-24 12:13:19
“1. 沒有問題，20k的我也轉(zhuǎn)過”
之前做了二個(gè)6+2K的，很順利，陽性率接近100%，這次10k, 我以為算大的了呢~

“2. 個(gè)人一般做60s”
你做的時(shí)候，用的什么管子呢？據(jù)說這個(gè)管子的厚薄對(duì)轉(zhuǎn)化是有影響的，管子薄 ...

就是普通的1.5ml管，我用水浴，沒什么問題。

對(duì)于連接的轉(zhuǎn)化，如果要是室溫連接，那么你的感受態(tài)最好效率高些。

平板上標(biāo)記不是很常用的操作么？你挑選克隆的時(shí)候，圈上，標(biāo)記，然后回頭找的時(shí)候知道哪個(gè)菌落對(duì)應(yīng)哪個(gè)菌液。

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21樓2014-05-25 02:39:45

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DAX1

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19樓: Originally posted by 隨風(fēng)飄搖11 at 2014-05-24 17:45:21
嗯，我們實(shí)驗(yàn)室都是用的Takara的酶，我的是PAS2 載體，基因1700bp,用的spe1和nde兩個(gè)酶，37°切三個(gè)小時(shí)，酶切后跑膠，和空載體比較是切開了（但是切完全沒有我也就不知道了），酶連轉(zhuǎn)化能長(zhǎng)出來菌，但是挑了60/70 ...

你要是擔(dān)心酶切不完全，可以多切幾個(gè)小時(shí)，我一般處理載體都會(huì)酶切6-8個(gè)小時(shí)。和你所說的一樣，你看不出來單酶切或者雙酶切的區(qū)別（除非兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間的序列超過一定長(zhǎng)度）。不知道你連接時(shí)候做了自連對(duì)照沒有？就是將片段換成水，如果你的自連和你的片段連接都差不多的話，那證明你的酶切是有問題的。至于連接體系比列，和我上面說的那樣，摩爾比1:1到1:3之間都可以，你可以Google下怎么計(jì)算，況且粘端的話，一般情況隨便多少都可以連進(jìn)去的。至于你的載體能否藍(lán)白篩選，你得看你得載體信息啊，你們買載體時(shí)應(yīng)該有protocol吧。其實(shí)藍(lán)白篩選也沒多大得意義。因?yàn)槟阈矢叩们闆r下，基本都沒有藍(lán)斑，而且白斑也不都是陽性。

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22樓2014-05-25 03:15:41

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22樓: Originally posted by DAX1 at 2014-05-25 03:15:41
你要是擔(dān)心酶切不完全，可以多切幾個(gè)小時(shí)，我一般處理載體都會(huì)酶切6-8個(gè)小時(shí)。和你所說的一樣，你看不出來單酶切或者雙酶切的區(qū)別（除非兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間的序列超過一定長(zhǎng)度）。不知道你連接時(shí)候做了自連對(duì)照沒有？ ...

自連對(duì)照應(yīng)該就是就是只切載體，然后連接做轉(zhuǎn)化，如果能夠長(zhǎng)出來菌就說明酶切沒有完全？是這樣子嗎？

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天道酬勤

23樓2014-05-25 08:20:39

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18樓: Originally posted by DAX1 at 2014-05-24 17:34:11
100挑一個(gè)，好吧，樓主你真幸運(yùn)。一般雙酶切不會(huì)有問題的，你可以考慮用下NEB的酶。理論上來說粘端嘛，應(yīng)該只有陽性克隆，你得效率實(shí)在太低了，做一個(gè)克隆還好，你要是做很多的克隆那還不累死了。...

恩，這次是運(yùn)氣好，接下來的兩個(gè)載體肯定不能這么做了~~

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24樓2014-05-25 14:43:15

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21樓: Originally posted by meng_xu at 2014-05-25 02:39:45
就是普通的1.5ml管，我用水浴，沒什么問題。

對(duì)于連接的轉(zhuǎn)化，如果要是室溫連接，那么你的感受態(tài)最好效率高些。

平板上標(biāo)記不是很常用的操作么？你挑選克隆的時(shí)候，圈上，標(biāo)記，然后回頭找的時(shí)候知道哪個(gè)菌落 ...

哈哈，我以前都是直接挑，搖菌，然后檢測(cè)，所以沒標(biāo)記過~現(xiàn)在想早點(diǎn)知道結(jié)果，才想到了先檢測(cè)然后才搖菌~

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25樓2014-05-25 14:45:18

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23樓: Originally posted by 隨風(fēng)飄搖11 at 2014-05-25 08:20:39
自連對(duì)照應(yīng)該就是就是只切載體，然后連接做轉(zhuǎn)化，如果能夠長(zhǎng)出來菌就說明酶切沒有完全？是這樣子嗎？
...

是的，就是將你的片段換成水，多做個(gè)連接和轉(zhuǎn)化

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26樓2014-05-26 02:52:31

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xiaofang1222

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1、可以嘗試載體和片段的不同連接比例
2、用電轉(zhuǎn)的方法試下
3、42度熱擊50s-90s

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27樓2015-06-04 10:15:36

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piaoyidetian

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【答案】應(yīng)助回帖

連接體系加PEG（配套的有）會(huì)提高成功率

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28樓2015-06-04 14:39:32

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