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鬼羽帝魂

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6樓: Originally posted by 小冀- at 2014-07-25 13:13:11
純化是什么意思？載體和目的片段都是跑膠回收的···熱擊后，我冰浴了2min，然后才活化的···...

純化就是跑膠回收，現(xiàn)在看來最大可能是連接這里有點小問題了吧。

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11樓2014-07-25 15:04:06

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鬼羽帝魂

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把連接體系寫上來，以及片段載體多大，濃度多大。

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12樓2014-07-25 15:05:20

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usky_4

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gyesang: 金幣+3, 鼓勵回帖交流！ 2014-07-25 21:58:19
小冀-: 金幣+1, ★有幫助 2014-07-26 09:24:40

這個載體應(yīng)該是可以做藍(lán)白斑篩選的吧，做個藍(lán)白斑很容易就能看出來有沒有插入基因。一般白斑的插入率應(yīng)該有90%，你的目的片段略大，可能會稍微低一些。確認(rèn)一下這個大小是否超過了載體的上限。

不知道你的連接體系是怎樣的，你的片段跟載體的大小基本差不多，所以要多加目的片段進(jìn)行連接，用3：1甚至5：1的比例，加大目的片段的插入效率。沒用過這個載體，也確認(rèn)一下這個載體是不是能直接用來TA克隆。

至于你后來說的雙酶切后進(jìn)一步克隆，體系是怎樣的？你的目的基因有相應(yīng)的酶切位點么？

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下次再見面的時候，我們一定會笑著相遇吧

13樓2014-07-25 21:29:31

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sj082csh

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小冀-(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+1, 鼓勵回帖交流 2014-07-26 17:01:44

你好，可能是你的目的片段太長了。。建議您換一下連接體系。 PMD19-T中，T4連接酶在solution I 里，好像本身連接效率就不高，況且你的片段3.6K

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14樓2014-07-25 23:21:31

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gaoyu_8848

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【答案】應(yīng)助回帖

★
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小冀-: 金幣+1, ★★★很有幫助 2014-07-26 09:30:56

原因是片段太長， 3.6K要連上去很難，因為載體也差不多是這么大。考慮把3.6k擴(kuò)3個小1k左右的小片段，分步連上去。需要找到重合處的唯一內(nèi)切酶位點。

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15樓2014-07-26 00:15:41

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小冀-

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15樓: Originally posted by gaoyu_8848 at 2014-07-26 00:15:41
原因是片段太長， 3.6K要連上去很難，因為載體也差不多是這么大�？紤]把3.6k擴(kuò)3個小1k左右的小片段，分步連上去。需要找到重合處的唯一內(nèi)切酶位點。

這樣的話，如果3個小片段有任何一個出現(xiàn)問題，那我的蛋白不就表達(dá)不了了嗎？？？

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16樓2014-07-26 09:22:22

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13樓: Originally posted by usky_4 at 2014-07-25 21:29:31
這個載體應(yīng)該是可以做藍(lán)白斑篩選的吧，做個藍(lán)白斑很容易就能看出來有沒有插入基因。一般白斑的插入率應(yīng)該有90%，你的目的片段略大，可能會稍微低一些。確認(rèn)一下這個大小是否超過了載體的上限。

不知道你的連接體 ...

一步克隆時只是在雙切基礎(chǔ)上加了一段同源臂，目的基因里沒有雙切用到的兩種酶，都是設(shè)計引物的時候加上去的···

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17樓2014-07-26 09:24:28

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12樓: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2014-07-25 15:05:20
把連接體系寫上來，以及片段載體多大，濃度多大。

DNA：0.5u（71.5ng）
buffer:4u
enzyme:2u
PMD-19T:5.2u(54.08ng)
H2O:8.3u

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18樓2014-07-26 09:29:18

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18樓: Originally posted by 小冀- at 2014-07-26 09:29:18
DNA：0.5u（71.5ng）
buffer:4u
enzyme:2u
PMD-19T:5.2u(54.08ng)
H2O:8.3u...

你的DNA片段是多少bp？

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19樓2014-07-26 10:34:06

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小冀-(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+2, 鼓勵回帖交流 2014-07-26 17:02:12

引用回帖:

18樓: Originally posted by 小冀- at 2014-07-26 09:29:18
DNA：0.5u（71.5ng）
buffer:4u
enzyme:2u
PMD-19T:5.2u(54.08ng)
H2O:8.3u...

按這個體系做下：
PMD-19T: 5ul 【0.03pmol】
DNA： 99*DNA大小/（1000*140）ul 【0.15pmol】
5Xbuffer: 2ul
enzyme: 1ul
補(bǔ)水到10ul。
16度連接8-10h，做轉(zhuǎn)化。

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20樓2014-07-26 10:42:10

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