|
|
硅烷化單分子膜在玻璃片、石墨和云母表面的蛋白質(zhì)固定化中的應(yīng)用
凌波麗
2014年8月23日
硅烷化單分子膜應(yīng)用在玻璃片等二氧化硅基片的表面的蛋白質(zhì)固定化已經(jīng)是比較的生物固定化技術(shù)。玻璃片、石墨和云母是掃描電子顯微鏡觀察蛋白質(zhì)的常用的載體。石墨和云母到含有大量的二氧化硅成分，且二氧化硅成分石墨和云母與其他成分呈現(xiàn)比較均衡的混合式分布，即在石墨和云母的表面的組成的比例中有足夠比例的二氧化硅。與此同時(shí)，二氧化硅也是硅玻璃的主要成分，因此把蛋白質(zhì)樣品固定在玻璃片表面的硅烷化單分子膜的實(shí)驗(yàn)方法也能夠適用于在石墨和云母片狀材料上的固定化。如果要在玻璃片等二氧化硅基片的表面覆蓋上硅烷化單分子膜的前提是：玻璃片等二氧化硅基片的表面不需要有含有游離的羥基的活性的硅醇存在，如圖1所示，而且也不是所有的硅醇都能夠發(fā)生硅烷化反應(yīng)。
圖1.“Types of hydroxyl group on silica surfaces. These are four possible types of SiOH groups on silica surfaces in which only the geminal and isolated silanols（硅醇） are reactive. Siloane(硅氧烷)和Vicinal silanol（硅醇）是沒(méi)有反應(yīng)活性的�！保▓D1及其說(shuō)明文字引自：A.Cass and F.Ligler edit,Immobilized Biomolecules in Analysis—A Practical Approach,Oxford University Press,1999,3）這也就是說(shuō)要在玻璃表面形成有反應(yīng)活性的geminal silanol and isolated silanol這兩種硅醇，而Siloane(硅氧烷)和Vicinal silanol是沒(méi)有反應(yīng)活性的，
本文參考資料與下載處：
1.A.Cass and F.Ligler edit,Immobilized Biomolecules in Analysis—A Practical Approach,Oxford University Press,1999, 1-78,171-186.
全書(shū)下載：http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=578928
2.J.M.Guisan edits, Immobilization of Enzyme and Cell,Humana Press,2006,185-203.
全書(shū)下載：http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=7808926
3.P.C.Braga and D.Ricci, Atomic Force Microscopy, Huamana Press,2003, 1-49, 217-254, 291-313.
全書(shū)下載：http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=7808991
文中大量引用各位專(zhuān)家學(xué)者的圖像和文字資料，僅僅用于科研交流的非營(yíng)利性目的，并且全部給出了出處，同時(shí)對(duì)各位專(zhuān)家學(xué)者深表感謝！
一、 玻璃片等二氧化硅基片的表面的羥基化形成活性硅醇
有些玻璃的表面本來(lái)就有羥基存在，但是不是說(shuō)這些羥基就必定會(huì)大量存在和穩(wěn)定存在。而不幸的是現(xiàn)在不少的生物份固定化和生物芯片的實(shí)驗(yàn)手冊(cè)的實(shí)驗(yàn)出發(fā)點(diǎn)都是玻璃的表面本來(lái)就有羥基存在，當(dāng)然這也是因?yàn)楹芏嗟膶?shí)驗(yàn)室是直接購(gòu)買(mǎi)表面本來(lái)就有羥基存在的實(shí)驗(yàn)用的載玻片或二氧化硅基片。但是如果沒(méi)有這個(gè)條件，我們就必須用普通玻璃自行制備玻璃表面的羥基了。
玻璃片表面的羥基化的實(shí)驗(yàn)步驟（舉例）：
Protocol 1.玻璃片表面的羥基化
材料：
雙氧水，濃硫酸，去離子水，乙醚
方法：
1.把需要的玻璃片切割成需要的形狀，放入裝有去離子水的燒杯，并且封口膜封口。
2.對(duì)于上面的燒杯用超聲波處理30min，就是清洗玻璃片表面。
3.在第2步處理完畢之后，倒掉燒杯里的去離子水，放入新的去離子水，然后封口，再用超聲波處理30min。再重復(fù)操作次清洗過(guò)程3-4次。
4.倒掉燒杯中的去離子水，倒入適量乙醇（70%濃度的乙醇即可）沖洗一下玻璃片和燒杯，然后倒掉乙醇，再加入同樣濃度的乙醇溶液，再用超聲波處理約10min。
5.倒掉燒杯中的乙醇，倒入適量乙醚沖洗一下玻璃片和燒杯，然后倒掉乙醚，再加入同樣濃度的乙醚，再用超聲波處理約10min。
6.倒掉燒杯里的乙醚，然后用氮?dú)獯蹈墒Ｏ碌臍埩粢颐选?br />
7.將上述處理過(guò)的玻璃片放入濃硫酸和雙氧水體積比3:1，在80至90度的水浴鍋中浸泡1到2小時(shí)。要先加加雙氧水進(jìn)燒杯，后加濃硫酸燒杯，必須將濃硫酸緩緩地沿器壁注入水中，同時(shí)在注酸入水的過(guò)程中要不停地?cái)嚢�，以便散熱。因�(yàn)闈饬蛩崛苡谒捎跐饬蛩崛苡谒校c水結(jié)合成水合物時(shí)放出大量的熱，如果后加水，會(huì)導(dǎo)致硫酸飛濺所以先加濃硫酸，水少起不到吸熱的作用，可能會(huì)使得濃硫酸飛濺出來(lái)傷人。先加水，后加酸，酸少，所以每單位時(shí)間的發(fā)熱量少，且雙氧水的比熱較大，又在攪拌，升溫不明顯。雙氧水在這里與濃硫酸混合時(shí)與水的作用差不多。比較保險(xiǎn)的辦法，混合雙氧水和濃硫酸時(shí)，將容器置于一個(gè)更大的容器——比如盆中，在位于盆里的裝盛濃硫酸和雙氧水的燒杯的周?chē)胖么罅康谋鶋K（緊貼著燒杯壁），然后再用前面的混合操作。操作時(shí)要帶上耐酸腐蝕的手套和穿上白大衣，最好再戴上帽子、口罩和護(hù)目鏡。在做實(shí)驗(yàn)時(shí)被嘲笑“怕死”，沒(méi)有什么關(guān)系，比真的發(fā)生事故要好得多。這步實(shí)驗(yàn)有一定危險(xiǎn)性，請(qǐng)事先查閱有關(guān)“濃硫酸稀釋”的實(shí)驗(yàn)操作方法。配制濃硫酸和雙氧水體積比3:1的反應(yīng)液可以與清洗玻璃片的工作平行進(jìn)行。
8.棄去反應(yīng)后的濃硫酸和雙氧水混合液入專(zhuān)門(mén)的廢液缸里，并加入氫氧化鈉，使其成為中性。取出處理過(guò)的玻璃片，用去離子水沖洗干凈，然后用氮?dú)獯蹈伞?br />
9.檢測(cè)玻璃片表面的羥基化效果。可以用紅外傅里葉變換光譜檢測(cè)玻璃片上是否有羥基的特異性吸收峰，這是最為方便的檢測(cè)方法。
現(xiàn)在已經(jīng)有表面經(jīng)過(guò)活化的帶有羥基或者氨基的玻璃產(chǎn)品出售，用作生物芯片實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)材料。
石墨和云母的表面通過(guò)二氧化硅的羥基化反應(yīng)基本上可以用上述的實(shí)驗(yàn)操作，因?yàn)槠渲械亩趸枧c其他成分是以混合物形式存在于石墨和云母中，后兩者的表面也應(yīng)該有不少二氧化硅成分，因此能夠通過(guò)Protocol 1的操作，在石墨和云母的表面形成有反應(yīng)活性的geminal silanol and isolated silanol兩種硅醇。
二、硅烷在玻璃等二氧化硅基片的表面與硅醇的羥基反應(yīng)形成帶有活性基團(tuán)的單分子層
在含有二氧化硅的介質(zhì)表面一般會(huì)用硅烷化反應(yīng)是過(guò)羥基共價(jià)連接上一層單分子膜作為結(jié)合蛋白質(zhì)的連接體的最容易的和最有效的一種方法。硅烷有很多種，既然用于在石墨和云母的表面要固定蛋白質(zhì)，那么用3-巰基丙基三甲氧基硅烷(3-mercaptopropytrimethoxysilane,MPTS) 或者1,3-Trimethoxysilylpropylethylene（1,3三甲氧基丙基甲硅烷基乙烯）。
3-氨基丙基三甲氧基硅烷(3-aminopropytrimethoxysilane)的結(jié)構(gòu)式及其與二氧化硅基片的表面的羥基的反應(yīng)時(shí)見(jiàn)圖1（引自：A.Cass and F.Ligler edit,Immobilized Biomolecules in Analysis—A Practical Approach,Oxford University Press,1999,76）所示，3--巰基丙基三甲氧基硅烷與氨基丙基三甲氧基硅烷的不同點(diǎn)就是把3-氨基丙基三甲氧基硅烷的頭上的氨基換成了巰基而已，兩者的三條甲氧基腿都是一樣的，而且氨基和巰基離三條腿上的甲氧基都挺遠(yuǎn)，所以?xún)烧吲c二氧化硅基片的表面的羥基的反應(yīng)的條件都差不多。
圖2（引自：A.Cass and F.Ligler edit,Immobilized Biomolecules in Analysis—A Practical Approach,Oxford University Press,1999,76）
Figure 2“ (a) A diagram of an aminosilane molecule is depicted (/eft), (b) The reaction of the aminosilane's methoxy groups（氨基硅烷的甲氧基基團(tuán)） is shown (right), where x can be the glass surface, hydrogen (i.e. water), or another aminosilane（氨基硅烷） molecule. The role of water in determining the extent of cross-linking with other aminosilane（氨基硅烷） molecules is apparent from this schematic.”（圖2的文字說(shuō)明引自：A.Cass and F.Ligler edit,Immobilized Biomolecules in Analysis—A Practical Approach,Oxford University Press,1999,76）
下面給出具體的3--巰基丙基三甲氧基硅烷(3-mercaptopropytrimethoxysilane,MPTS)共價(jià)連接在二氧化硅基片的表面的羥基形成了單層的分子膜的反應(yīng)的Protocol,引自：A.Cass and F.Ligler edit,Immobilized Biomolecules in Analysis—A Practical Approach,Oxford University Press,1999,74.除了加上一些比較專(zhuān)業(yè)的術(shù)語(yǔ)的中文釋義外，為了更加明確實(shí)驗(yàn)流程能夠用于玻璃片，我把實(shí)驗(yàn)流程中的基片的敘述中的“ glass slides(載玻片)”直接放到了Reagents欄目里，并且把原來(lái)的Reagents改為了Reagents and Materials。
我把完整的實(shí)驗(yàn)流程貼在這里是因?yàn)楝F(xiàn)成的包括玻璃片在內(nèi)的二氧化硅基片的表面的硅醇的羥基與3--巰基丙基三甲氧基硅烷(3-mercaptopropytrimethoxysilane,MPTS)共價(jià)連接在二氧化硅基片的表面的羥基形成了單層的分子膜的反應(yīng)的Protocol,不好找，分散在各個(gè)SCI論文中，而在實(shí)驗(yàn)手冊(cè)中難找到。
Protocol 2.“Deposition（沉淀、沉積） of silanes 'monolayers'（硅烷單分子層） on SiO2 and glasses as adhesion layers to promote the attachment of gold and platinum
Reagents and Materials
. MPTS (3-mercaptopropytrimethoxysilane,MPTS，3--巰基丙基三甲氧基硅烷)
. iPA（異丙醇）
. glass slides(載玻片)
Method
1. Always use fresh MPTS ((3-mercaptopropytrimethoxysilane,MPTS，3--巰基丙基三甲氧基硅烷,Sigma), as the cost of the silane（硅烷） is low relative to cost of the gold used in the evaporation. Silanes (3-mercaptopropytrimethoxysilane,MPTS，3--巰基丙基三甲氧基硅烷) should be kept refrigerated prior to use, and allowed to come to room temperature before opening, thus avoiding condensation of atmospheric moisture（大氣濕度） into the stock solution. Old solutions oligomerize and the mercapto（巰基） groups oxidize, thus making them less effective in bonding the evaporatedAu.
2. Place the substrates (which may typically be several glass slides(載玻片) )in a suitable holder (slide rack) and immerse in a wide brimmed reflux vessel containing a solution of 400 ml iPA, 10 g MPTS(3-mercaptopropytrimethoxysilane,MPTS，3--巰基丙基三甲氧基硅烷), and 10 g H2O.
3. Reflux（逆流、倒流） the solution for c. 10 min and then place the reflux vessel in a
bowl of cold water to speed cooling of the solution prior to the removal of the substrates.
4. On removal from the cooled solution, place the substrates in a beaker （燒杯）of iPA and leave for several minutes to allow the silane-containing solution to be rinsed off the substrate/holder surfaces.
5. Rinse well with iPA（異丙醇）, blow dry as above, and then bake in 105°C oven for 10 min. If the oven temperature exceeds 115°C, the thiol（巰基） will always oxidize and the gold will not adhere. Remember the coating is only a few atoms thick, and the oxidation reaction is irreversible.
6. The procedure for coating the substrate with the mercaptosilane（巰基硅烷） should
be repeated at least once, in order to ensure complete coverage.
7. Evaporate the gold or platinum A00 nm) within one day of preparing samples, otherwise the substrates will get covered in adventitious 'dirt' and an increasing proportion of the modifier's thiol（巰基） groups will oxidize. Note in the authors' laboratories it has been shown using XPS measurements that after two days 50% of the surface sulfur species
(which will interact with the evaporated metal) have been oxidized. ”XPS： X-ray photoelectron， X射線(xiàn)光電子能譜。
——Protocol 2引自：A.Cass and F.Ligler edit,Immobilized Biomolecules in Analysis—A Practical Approach,Oxford University Press,1999,74.
石墨和云母富含有二氧化硅，其表面也有二氧化硅，經(jīng)過(guò)Protocol1的處理，其表面也會(huì)出現(xiàn)有反應(yīng)活性的geminal silanol and isolated silanol這兩種硅醇，那么就當(dāng)作比較粗糙的二氧化硅基片來(lái)共價(jià)連接硅烷的單分子層。
三、玻璃等二氧化硅基片的表面的硅烷化的單分子層的形成后，如何在單分子層上共價(jià)連接上蛋白質(zhì)。
3--巰基丙基三甲氧基硅烷在二氧化硅基片表面的形成的單分子層上游離的巰基，該巰基能夠需要固定的蛋白質(zhì)的分子表面的巰基形成二硫鍵，以達(dá)到需要固定的蛋白質(zhì)于二氧化硅介質(zhì)表面的3--巰基丙基三甲氧基硅烷單分子層的目的，也就把固定的蛋白質(zhì)固定在了二氧化硅基片。石墨和云母富含有二氧化硅，其表面也有二氧化硅，那么就當(dāng)作比較粗糙的二氧化硅基片來(lái)加工上硅烷的單分子。
3--巰基丙基三甲氧基硅烷單分子層在二氧化硅介質(zhì)表面的形成的反應(yīng)流程也基本上適用于：3-氨基丙基三甲氧基硅烷(3-aminopropytrimethoxysilane)共價(jià)連接在二氧化硅基片的表面的羥基形成了單層的分子膜的反應(yīng)。
3--巰基丙基三甲氧基硅烷上的游離的巰基具體如何共價(jià)結(jié)合蛋白質(zhì)分子的實(shí)驗(yàn)流程請(qǐng)參考：J.M.Guisan edits, Immobilization of Enzyme and Cell,Humana Press,2006,193-203，內(nèi)容比較多，就不再引述，請(qǐng)直接參考原文。
3-氨基丙基三甲氧基硅烷(3-aminopropytrimethoxysilane)因?yàn)橛袀�(gè)游離的氨基，所以在固定化蛋白質(zhì)的時(shí)候非常有價(jià)值，可以用碳二亞胺（carbodiimide）催化蛋白質(zhì)分子表面的游離的羧基與3-氨基丙基三甲氧基硅烷(3-aminopropytrimethoxysilane)形成酰胺鍵構(gòu)成蛋白質(zhì)固定于有3-氨基丙基三甲氧基硅烷(3-aminopropytrimethoxysilane)單層分子膜的SiO2的基片上；也可以用戊二醛作為橋梁，把蛋白質(zhì)分子表面的游離的氨基與3-氨基丙基三甲氧基硅烷(3-aminopropytrimethoxysilane)的游離氨基分別與形成戊二醛形成共價(jià)鍵,而達(dá)到交聯(lián)的效果。具體實(shí)驗(yàn)流程如下：
Protocol 3.“Protein immobilization with aminopropyltriethoxysilane （3-氨基丙基三甲氧基硅烷）and glutaraldehyde（戊二醛）
Equipment and reagents
• Vacuum oven • Carbonate buffer: 0.1 M sodium carbonate
• 3-aminopropyltriethoxysilane (APTS) PH 9•2
(Aldrich, Sigma) • Glycine
• Absolute ethanol • 0.2 M ethanolamine
• Glutaraldehyde, E.M. grade {Sigma, Poly- • Antibody solution: 0.5 mg/ml in carbonate
Sciences) buffer
• PBS
Method
1. Immerse the solid support in 5% APTS in distilled water for 30 min at room temperature.
2. Rinse the silanized support thoroughly with distilled water and absolute ethanol sequentially.
3. The support is then cured in a vacuum oven at 80°C overnight.
4. Immerse the silanized support in a 2.5% glutaraldehyde solution in carbonate buffer for 2 h.
5. Rinse the treated support thoroughly with PBS.
6. Immerse the modified support in a 0.5-0.6 mg/ml antibody solution for 7-8 h.
7. Rinse the antibody coated support thoroughly with PBS.
8. To block the unreacted aldehyde groups, the antibody coated support is immersed in either 0.2 M ethanolamine or 0.1 M glycine for 1 h.
9. The final product is rinsed thoroughly with distilled water and stored in PBS.”
———Protocol 3引自：A.Cass and F.Ligler edit,Immobilized Biomolecules in Analysis—A Practical Approach,Oxford University Press,1999,9-10.
Protocol 4.”P(pán)rotein immobilization with aminopropyltriethoxysilane（3-氨基丙基三甲氧基硅烷） and carbodiimide（碳二亞胺）
Equipment and reagents
• Water-bath (75°C) • Phosphate buffer: 0.03 M H3PO4, pH 4
• Oven(爐，115°C) • 1-cyclohexyl-3-B-morpholinoethyl)carbodiimide (一種碳二亞胺，CMEC)
• Aminopropyltriethoxysilane (3-氨基丙基三甲氧基硅烷，APTS)
• Hydrochloric acid (HCI) • PBS
Method
1. Immerse the cleaned solid support into a 10% (v/v) APTS in distilled
water.
2. Adjust the pH of the silane solution to between pH 3-4 with 6 M HCI.
3. Place the silane（硅烷） /support mixture in a water-bath at 75°C for 2 h.
4. Rinse（沖洗、漂洗） the solid support thoroughly with distilled water.
5. Dry the silanized support in an oven at 115°C for a minimum of 4 h.
6. Place the silanized（硅烷化的） support in 0.03 M H3PO4 buffer and add 2-4 mg/ml CMEC(一種碳二亞胺). Mix the solution thoroughly.
7. Add the protein solution （2 mg/ml) to the CDI/support solution, mix, and incubate overnight at 4°C.
8. Rinse the protein coated support and store in PBS.”
———Protocol 4引自：A.Cass and F.Ligler edit,Immobilized Biomolecules in Analysis—A Practical Approach,Oxford University Press,1999,10-11.
以上，我只是做了很簡(jiǎn)單的舉例說(shuō)明了硅烷化單分子膜在玻璃片、石墨和云母表面的蛋白質(zhì)固定化中的應(yīng)用，即使是硅烷化單分子膜在在玻璃片、石墨和云母表面的形成也含有很多，蛋白質(zhì)的固定化的生物技術(shù)更是繁多。從我本人對(duì)此文的書(shū)寫(xiě)過(guò)程，我自己的確學(xué)到了很多的東西，至少現(xiàn)在對(duì)于硅烷化單分子膜有了初步的了解，原來(lái)連什么是硅烷試劑都不知道，雖然我的課題一部分涉及到蛋白質(zhì)的固定化。硅烷化單分子膜在玻璃片、石墨和云母表面的蛋白質(zhì)固定化中的應(yīng)用限于作者的水平、時(shí)間限制和本文的回答樓主的目的，不可能更多的涉獵，衷心希望對(duì)各位有興趣的網(wǎng)友們起到拋磚引玉的目的，限于本人水平有限，錯(cuò)訛之處難免，還望予以指正。 |
|
回復(fù)此樓
酷戀花
