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yuevis銅蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
PCR出不來(lái)目的條帶
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我想overlap pcr把上下同源臂和目的基因連在一起，從基提取的細(xì)菌基因組上擴(kuò)增上下同源臂，沒(méi)有目的條帶，有很多比目的條帶小或者接近的雜帶，請(qǐng)問(wèn)這是怎么回事啊，很急啊，我的引物是這樣的 F1:AACTTGTGACGGAGGCG R1:CTGACGTATAGATGACATAAGCCAGATCTGTCGCTTCGGTGC F2:GCTTGCGAGAGGTTACCTGAACCGGCCGGAGCTGAC R2:TTCCAGCGGAGTCCGA 重疊區(qū)25bp左右，primer給的Tm是52和54左右，合成單上是54和56度左右，我試了退火溫度48，50，52，54，56效果都不好，雜帶很多，目的條帶有的沒(méi)有，有的很淡。我之前想的是就算特異性不好，之后膠收就行了，現(xiàn)在是連條帶都沒(méi)有，用的是fastpfu酶，做的10微升體系。求教各位啊! 發(fā)自小木蟲(chóng)Android客戶端 |
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2樓2017-11-30 06:33:35
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剛開(kāi)始做，很多不懂，我想的是那10微升試條件的，體系會(huì)有很大影響嗎?還有出現(xiàn)很多雜帶是不是說(shuō)明提取的基因組和體系是沒(méi)問(wèn)題的?一般用什么酶?實(shí)驗(yàn)室只有fastpfu酶 發(fā)自小木蟲(chóng)Android客戶端 |
3樓2017-11-30 07:05:56
wareer
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你這應(yīng)該是要做載體的吧?用高保真的酶，引物設(shè)計(jì)可以用http://www.clontech.com/上面的infusion工具設(shè)計(jì)，我試過(guò)不錯(cuò)的。 發(fā)自小木蟲(chóng)Android客戶端 |
4樓2017-11-30 12:28:48
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感覺(jué)是引物設(shè)計(jì)有問(wèn)題，體系影響不大。是在做巢式PCR？所謂重疊區(qū)域25bp是兩輪的差值？ 發(fā)自小木蟲(chóng)Android客戶端 |
5樓2017-12-02 16:29:20
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6樓2017-12-02 18:37:56
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